结核分枝杆菌19kD-ESAT6融合蛋白的克隆表达及纯化

运用聚合酶链反应( PCR) 技术从结核分枝杆菌标准株H37Rv 中扩增获得19kD 脂蛋白和esat-6 基因片段, 将目的片段分别克隆到pMD18-T 载体, 再亚克隆目的片段到同一表达载体pET-21a, 构建重组表达载体pET21a-19kD-ESAT6, 转化至大肠埃希菌BL21( DE3) , 表达纯化后用蛋白质印迹法( Western blot) 分析其抗原反应性。结果成功构建了重组质粒pET21a-19kD-ESAT6, 并在大肠埃希菌中获得高效表达。SDS-PAGE 结果显示, 在相对分子质量( Mr) 约29 ×103 处有表达条带。estern blot 结果表明, 重组蛋白19kD-ESAT6 与确诊的结核病患者血清发生特异性免疫反应, 具有特异的抗原性。本研究构建的结核分枝杆菌19kD-ESAT6 融合蛋白为结核病血清学诊断试剂的开发提供了依据。     

二甲基胂酸抑制胃癌细胞增殖的研究

目的:探讨二甲基胂酸(DMAA)对SGC7901胃癌细胞增殖的抑制作用及其可能的机制.方法:依次用5,10,15,20,25,30mmol/L二甲基胂酸处理培养的SGC7901胃癌细胞24 hrs,在5 mmol/L和10 mmol/L的浓度下分别处理6,12,18.24,30,36,42,48hrs,用MTT计数法测定DMAA对肿瘤细胞增殖的抑制率,用激光共聚焦显微镜检测细胞形态变化以及用DNA凝胶电泳检测细胞凋亡.结果:DMAA在不同浓度下对肿瘤细胞的抑制作用呈现典型的双曲线,即随着浓度的增加DMAA对胃癌细胞的抑制率不断增加并逐渐趋于稳定;在形态学上DMAA在低浓度下引起胃癌细胞的胞膜出泡、核固缩、染色体断裂和凋亡小体等典型的细胞凋亡的变化,而在高浓度下主要引起细胞坏死;DNA凝胶电泳结果显示,在低浓度DMAA作用下胃癌细胞DNA呈现细胞凋亡的梯状带型,而在高浓度下梯状带型则消失.结论:DMAA抑制胃癌细胞的增殖,其在低浓度时能有效诱导胃癌SGC 7901细胞凋亡,而在高浓度时使胃癌细胞坏死而死亡.     

伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞自噬过程的影响

为研究伤寒沙门菌质粒pR_ST98对人巨噬细胞THP-1自噬过程的影响,以携带伤寒沙门菌质粒pR_ST98的野生株ST6、消除pR_ST98的突变株ST6-ΔpR_ST98和将pR_ST98经接合转移的回补株ST6-c-pR_ST98为受试菌,与THP-1共培养建立感染模型,并加入自噬作用阻断剂氯喹（CQ）进行干预。首先测定CQ单独作用对细胞及细菌的影响,确定CQ最适浓度;在细菌和细胞共作用后的不同时间点收集细胞,通过蛋白免疫印迹法(WB)和mRFP-GFP-LC3 质粒转染法检测细胞LC3Ⅱ蛋白、p62蛋白、自噬体及自噬溶酶体的变化。结果显示,30 μmol/L CQ对细胞自噬的阻断效果明显,且细胞存活率超过50%,对细菌也无明显影响。WB结果显示,用该浓度CQ干预后,ST6-ΔpR_ST98感染组细胞的LC3Ⅱ及p62表达量上升程度显著高于野生株ST6及回补株ST6-c-pR_ST98;CQ干预组3株受试菌感染细胞LC3点状结构数量均高于未加CQ组,且ST6-ΔpR_ST98感染细胞的点状结构数量明显增加。以上结果提示,伤寒沙门菌质粒pR_ST98在自噬前期发挥作用,早于溶酶体降解的过程。     

S-腺苷甲硫氨酸和谷胱甘肽联产发酵的环境条件

在5 L发酵罐中,研究pH、搅拌转速和温度等环境条件对产朊假丝酵母CCTCC M209298联产发酵合成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和谷胱甘肽(GSH)的影响,发现酵母细胞生长、SAM和GSH合成各自需要最适的pH、搅拌转速和培养温度。以SAM和GSH联产量最大化为目标,获得了较为合适的联产发酵条件:pH 5.0,搅拌转速350 r/min,温度30℃。在此环境条件下,结合不低于35%的溶氧体积分数,分批培养产朊假丝酵母24 h,最终SAM和GSH联产产量可达到579.6 mg/L。     

异育银鲫过氧化物还原酶基因的克隆及其表达分析

采用反转录PCR和cDNA末端快速扩增技术从异育银鲫Carassius auratus gibelio肝脏中克隆了过氧化物还原酶(Prx)基因的cDNA全长序列。结果显示,异育银鲫过氧化物还原酶(CaPrx)基因cDNA全长1035 bp,开放阅读框长594 bp,编码197个氨基酸。在氨基酸序列的N端和C端各有一个保守的Cys残基,属于2-半胱氨酸类Prxs家族。多序列比对和系统进化树分析表明,异育银鲫与鲫Carassius auratus、青鱼Mylopharyngodon piceus、斑马鱼Danio rerio、犀角金线鲃Sinocyclocheilus rhinocerous和朝鲜鳑鲏Rhodeus uyekii等鱼类的Prx基因具有很高的同源性。实时荧光定量PCR结果显示,CaPrx基因在异育银鲫体内广泛表达,在血细胞和肝脏中表达量最高,在鳃和头肾的表达量较少。在感染鲤疱疹病毒Ⅱ型的个体中,肝脏和脾脏的CaPrx基因表达量显著下降,表明其抗氧化作用因病毒的感染而受到了一定的破坏。     

饲料氧化鱼油引起草鱼肠道结构损伤、通透性增加

为了探讨饲料氧化鱼油对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道组织结构及其通透性的影响, 本实验以豆油、鱼油及氧化鱼油作为饲料脂肪源, 分别设计鱼油组(6F)、豆油组(6S)、2%氧化鱼油(4S2OF)、4%氧化鱼油(2S4OF)及6%氧化鱼油(6OF) 5组等氮、等能的半纯化饲料。经72d池塘网箱养殖后, 实验结果显示: (1)氧化鱼油显著增加(P0.05)草鱼血清和肠道MDA含量、增加肠道GSH含量(P0.05), 但随氧化产物含量上升GSH含量出现下降。(2)氧化鱼油会显著降低肠道内胆汁酸的含量(P0.05)。(3)氧化鱼油会显著增加肠道绒毛中杯状细胞的数量(P0.05), 且随着氧化产物的增加, 肠道微绒毛高度呈现先上升后下降趋势。(4)氧化鱼油会导致肠道紧密连接间隙增大, 增加肠道通透性, 使血清中D-乳酸及内毒素含量显著增加(P0.05)。结果表明, 饲料中鱼油氧化产物损伤了草鱼肠道组织结构, 尤其是肠道上皮细胞紧密连接结构损伤严重, 从而破坏了肠道黏膜的机械屏障功能, 使肠道通透性显著增加, 肠道细菌内毒素等发生转移。鱼油氧化产物会引起草鱼肠道氧化与抗氧化应激反应, 干扰草鱼肝-肠正常胆汁酸循环, 致使草鱼肠道胆汁酸不足。     

MDA对草鱼肠道黏膜结构屏障损伤和肝胰脏、肠道胆固醇、胆汁酸合成影响

正油脂为鱼类的生长提供能量和必需脂肪酸,因此在饲料中得到广泛应用。然而,油脂由于含有大量不饱和脂肪酸,特别是鱼油,在高温、高湿条件下特别容易氧化酸败,产生多种初级和次级氧化产物,这些氧化产物被鱼     

丝蛋白合成和分泌期家蚕丝腺中有氧氧化特性分析

【目的】有氧氧化中葡萄糖(Glc)、丙酮酸(PA)、乙酰Co A(AC)、还原型吡啶核苷酸(NADH)和腺苷三磷酸(ATP)摩尔数的理论比值为1∶2∶2∶10∶30~32,而己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶1(PFK1)、丙酮酸激酶(PK)、丙酮酸脱氢酶(PDH)、柠檬酸合酶(CS)、异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)、α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)、NADH泛醌还原酶(NCR)、琥珀酸泛醌还原酶(SCR)、泛醌细胞色素C还原酶(CCR)、细胞色素C氧化酶(CCO)和ATP合酶(AS)活性的理论比值为1∶1∶2∶2∶2∶2∶2∶10∶2∶12∶12∶26~28。本研究旨在分析丝蛋白合成和分泌期家蚕Bombyx mori丝腺有氧氧化的特性。【方法】利用分光光度法和高效液相色谱法测定了上述生化指标的变化。【结果】丝蛋白合成和分泌期家蚕丝腺中检测不到Glc,产物含量以1/30 ATP,1/10 NADH,1/2 AC和1/2 PA的顺序递增;糖酵解途径相关酶活性,以PFK1活性最低;三羧酸循环相关酶活性以1/2 ICDHm,1/2α-KGDH和1/2 CS的顺序递增;氧化磷酸化相关酶包括1/26 AS,1/10 NCR,1/2 SCR,1/12 CCR和1/12 CCO的活性以1/26 AS活性最低;1/26 AS,1/2 ICDHm,1/2 PDH和PFK1的活性依次递增。NADH含量、ATP含量、PFK1活性、PDH活性和NCR活性在丝蛋白合成期升高,但在丝蛋白分泌期下降。【结论】据此推测,家蚕丝腺中PFK1,ICDHm和AS分别是糖酵解途径、三羧酸循环和氧化磷酸化的限速酶;糖酵解途径、丙酮酸脱氢、三羧酸循环和氧化磷酸化速率依次递减;有氧氧化速率在丝蛋白合成期升高,相反在丝蛋白分泌期降低。     

雌核发育抗病草鱼与普通草鱼的免疫学指标比较

雌核发育抗病草鱼在养殖过程中已表现出较好的抗病能力,但对其抗病力的确定还缺乏有力的证据。通过对雌核发育抗病草鱼和相同饲养条件下普通草鱼的主要免疫球蛋白基因(Ig D、Ig Z和Ig M)相对表达量、免疫生化指标(白蛋白、碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶和肌酐)、血清溶菌酶活性等相关参数的比较,分析了雌核发育抗病草鱼的免疫能力。数据显示雌核发育抗病草鱼Ig Z、Ig M m RNA在血液和脾脏中的相对表达量、Ig D m RNA在头肾和脾脏中的相对表达量都与普通草鱼存在显著差异(P0.05);溶菌酶活性与普通草鱼存在显著差异(P0.05)。在免疫生化指标方面,雌核发育抗病草鱼也明显优于普通草鱼。研究结果肯定了雌核发育抗病草鱼在免疫机能方面的优越性。