铜绿假单胞菌PAO1中c-di-GMP代谢相关基因PA0575对表型的影响

【背景】铜绿假单胞菌PAO1中存在与环鸟苷二磷酸(cyclic-di-guanosine monophosphate,c-di-GMP)代谢相关基因PA0575。【目的】探讨铜绿假单胞菌PAO1中环鸟苷二磷酸代谢相关基因PA0575对运动能力及生物膜的影响。【方法】通过PCR对菌株遗传背景进行确认;利用刚果红结合实验及电转PcdrA-gfp质粒间接测量胞内c-di-GMP水平;利用泳动性(swimming)、蜂群泳动(swarming)、蹭行运动(twiching)和生物膜定量实验对细菌进行表型分析,并在运动培养基中添加抗生素研究其对运动能力的影响;针对PA0575基因进行融合蛋白表达载体的构建,并对蛋白进行原核诱导表达。【结果】3株突变体菌株的转座子插入突变位点不一致,胞内c-di-GMP水平检测结果显示,PA0575-1菌株的c-di-GMP含量高于野生型PAO1菌株(P0.05),PA0575-2、PA0575-3菌株胞内c-di-GMP水平与野生型PAO1菌株无差异(P0.05)。运动能力检测实验中,与野生型PAO1菌株相比,PA0575-1菌株泳动性增强(P0.05);PA0575-2、PA0575-3菌株的泳动性、蜂群运动均增强(P0.05);该基因不同位点的突变均导致氯霉素对菌株的运动能力产生抑制作用。生物膜定量结果显示,与野生型PAO1菌株相比,细菌培养18 h后PA0575-1的生物膜含量降低(P0.05),PA0575-2、PA0575-3菌株的生物膜含量升高。最后成功构建了PA0575基因不同结构域的8个表达载体,并获得了异源表达蛋白。【结论】PA0575基因降低铜绿假单胞菌胞内c-di-GMP的水平,影响表型的同时也抑制了氯霉素抗性基因的表达。以上研究为PA0575基因对表型的影响奠定了基础。     

二甲双胍改善多囊卵巢综合征并激活雌性生殖干细胞

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是生育年龄妇女常见的一种复杂的内分泌及代谢异常所致的疾病,是女性不孕的重要因素。二甲双胍是临床应用最广泛的经典口服降糖药物,近年来被应用于PCOS治疗,但其作用机制尚不明确。本研究通过建立小鼠PCOS模型,论证二甲双胍对PCOS的改善作用及其机制。4～5周龄雌性C57BL/6J小鼠连续21天给予来曲唑(每天灌胃1 mg/kg)联合高脂饮食,建立PCOS模型。成模后灌胃给予二甲双胍(每天200 mg/kg),1个月后取材,期间检测体重并进行糖耐量试验。取材后行苏木素-伊红(H&E)染色检测卵巢病理改变;ELISA法测定血清中抗缪勒氏管激素(anti-Mullerian hormone, AMH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、雌二醇(E2)、睾酮等激素水平;免疫组织化学及免疫荧光染色法检测雌性生殖干细胞(femalegermlinestemcells,FGSCs)标志物DDX4/MVH及PC...     

CD177~+中性粒细胞在溃疡性结肠炎患者外周血中的表达及临床意义

目的:通过对比CD177~+中性粒细胞在溃疡性结肠炎(UC)患者与正常对照者外周血中的表达差异,分析CD177~+中性粒细胞在溃疡性结肠炎发生发展中的临床意义。方法:收集30例UC患者及20例正常对照者外周血,采用流式细胞术检测中性粒细胞CD177~+中性粒细胞表达情况,对比两组CD177表达差异。结果:UC患者外周血中CD177~+中性粒细胞表达明显高于正常对照组(P 0. 01),中度活动UC外周血CD177~+中性粒细胞表达较轻度者明显增高(P 0. 05),UC患者外周血CD177~+中性粒细胞%与Mayo评分呈显著正相关(r=0. 384,P=0. 036)。结论:CD177~+中性粒细胞在UC患者外周血表达明显增高,且与疾病活动程度密切相关,能够反映UC患者临床疾病活动程度。     

自噬抑制肿瘤坏死因子α诱导人胎盘胎儿来源间充质干细胞发生凋亡

目的:探讨TNF-α诱导人胎盘胎儿来源间充质干细胞(hfPMSCs)发生凋亡和自噬的作用,以及自噬对细胞凋亡的调控作用。方法:利用流式细胞术检测无血清培养hfPMSCs中CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45的表达;用终浓度20μg/L的TNF-α处理hfPMSCs 24h,以未处理细胞作为对照组。Annexin V/PI双染色检测TNF-α对hfPMSCs凋亡程度的影响;分别提取各组总蛋白,Western blot检测自噬标志基因LC3Ⅰ/Ⅱ的表达;利用mRFP-GFP-LC3腺病毒感染细胞,观察胞内点状聚集形成的情况;利用Atg5干扰慢病毒(si-Atg5)及阴性对照慢病毒(si-NC)感染hfPMSCs,Annexin V/PI双染色检测TNF-α对慢病毒感染后hfPMSCs凋亡程度的影响。结果:所培养细胞具有典型的MSCs形态,呈CD73~+CD90~+CD105~+/CD14~-CD34~-CD45~-细胞; Annexin V/PI染色结果显示,TNF-α作用24 h后,hfPMSCs凋亡数和凋亡率均高于对照组(P 0. 05);Western blot检测自噬标志蛋白表达结果表明,TNF-α可增加LC3Ⅱ的表达(P 0. 05);荧光共聚焦显微境观察到TNF-α可显著提高细胞中的点状聚集。利用si-Atg5感染细胞,抑制hfPMSCs自噬的发生,与对照慢病毒si-NC感染细胞比较,可显著促进TNF-α诱导hfPMSCs凋亡的发生(P 0. 05)。结论:TNF-α诱导的自噬抑制人胎盘胎儿来源MSCs凋亡的发生,具有一定的保护性作用。     

SLC6A4基因多态性与海洛因依赖的关联性研究

目的:探讨5-羟色胺转运体基因(solute carrier family 6 member 4,SLC6A4)基因4个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点与海洛因依赖之间的关系。方法:严格按照诊断标准,选取无亲缘关系的海洛因依赖个体397例(病例组)及健康对照个体402例(对照组)提取基因组DNA,采用SNaPshot SNP分型技术对SLC6A4基因4个SNP位点(rs1042173,rs3813034,rs6354,rs7224199)进行基因分型,比较病例-对照组间各位点等位基因、基因型频率的差异。结果:病例组和对照组SLC6A4基因rs1042173和rs3813034位点的基因型和等位基因频率比较存在显著性差异(P0.05),rs1042173的C等位基因(P=0.031,OR=1.317,95%CI=1.026-1.691)及rs3813034的C等位基因(P=0.013,OR=1.375,95%CI=1.069-1.768)是海洛因依赖的危险因素。病例组TCC单倍型(rs7224199、rs3813034和rs1042173)的比例较对照组显著增高(P0.05)。结论:SLC6A4基因rs1042173和rs3813034多态性可能与海洛因成瘾有关,携带有rs1042173的C等位基因和rs3813034的C等位基因的个体及携带TCC单倍型的个体可能更容易对海洛因产生依赖。     

兰州地区腹泻患儿中人博卡病毒1～4型流行病学研究

了解兰州地区病毒性腹泻患儿中人博卡病毒1~4型(HBoV1~4型)的流行情况及临床特点,并探讨HBoV与急性胃肠炎的疾病相关性。收集兰州大学第一医院2012年7月至2013年6月5岁以下腹泻患儿的粪便标本331份,采用PCR方法检测人博卡病毒,同时检测常见的肠道病毒。331份标本中共检出博卡阳性标本49例(14.80%),其中HBoV1~4型分别检测出26例、15例、7例和1例。分析其流行规律发现HBoV相关的腹泻全年散发,无明显季节分布。HBoV感染的患儿年龄为11.04±6.92月龄,高发年龄是7~12月龄。2岁以下患儿占HBoV阳性患儿总数的93.88%。HBoV与其他病毒混合感染率为71.3%,以混合轮状病毒为主。HBoV感染对腹泻患儿的发热和呕吐发生率无明显影响。检测出一例罕见的HBoV4病毒LZFB086,与泰国(序列号JQ267789)参考株的同源性为99.0%。未检测出HBoV2B型。从研究结果得出我国兰州地区人博卡病毒以HBoVl为主,在我国首次发现HBoV4病毒。HBoV1~4与其他病毒的混合感染率高,主要是混合轮状病毒。HBoV可能不是导致急性胃肠炎的致病病原。     

幽门螺旋杆菌ATCC 43504感染BALB/c小鼠动物胃炎模型的建立及分析

利用幽门螺旋杆菌标准菌株建立稳定可靠的幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染小鼠胃炎模型对Hp疫苗研制、Hp致病机制的研究及抗Hp药物的筛选具有重要意义。通过灌胃国际标准菌株幽门螺旋杆菌Hp ATCC 43504,构建了BALB/c小鼠动物胃炎模型。利用小鼠胃部Hp尿素酶活性检测、Hp的定量培养、PCR检测、组织病理学等多种方法鉴定BALB/c小鼠动物胃炎模型。通过Hp诊断试剂盒检测,造模组小鼠的胃组织能使Hp尿素酶试剂变色,呈现玫瑰红色,而健康小鼠的胃组织不能使Hp尿素酶试剂变色,依旧呈现黄色;通过小鼠胃组织匀浆液培养Hp,造模组小鼠的胃组织匀浆液均可在BHI血平板长出Hp菌落,而对照组小鼠的胃组织匀浆液不能培养出Hp菌落;利用PCR对造模组和对照组BALB/c小鼠的胃组织进行Hp检测,造模组小鼠胃组织可扩增出150 bp的DNA产物,而对照组小鼠胃组织无扩增产物;通过HE染色法观察小鼠胃部病理变化和炎症情况,与健康BALB/c小鼠比较,造模组小鼠胃粘膜和粘膜下层有大量白细胞浸润,胃部炎症明显。利用国际标准菌株Hp ATCC 43504菌株成功构建了BALB/c小鼠胃炎模型,为评价防治Hp感染药物的效果奠定了实验基础。     

海马皮质特异性敲除AEG-1基因小鼠的构建及其行为学初步研究*

星形胶质细胞上调基因-1(astrocyte upregulating gene-1,AEG-1)是HIV伴随老年痴呆患者脑组织中发现的星形胶质细胞上调基因之一,近年来研究表明其调控多种中枢神经系统疾病,但其在学习认知上的研究尚未见报道。海马和皮质在学习认知中起重要作用,利用CRISPR/Cas9技术结合Cre/loxp系统构建海马皮质特异性AEG-1敲除小鼠,在此模型鼠的基础上对AEG-1和学习认知的相关性进行初步研究。首先构建插入loxp位点的flox纯合型AEG-1^fl/fl小鼠,与海马、新皮层特异性表达Cre^+/+重组酶的工具鼠进行繁育,利用PCR技术筛选出子代基因型为AEG-1^fl/fl Cre⁺的海马皮质特异性AEG-1敲除小鼠;然后利用Western blot技术和免疫荧光技术检测AEG-1基因在小鼠海马皮质中的敲除效率;最后应用新物体识别箱和三腔社会互动箱并结合SMART 3.0分析系统,对海马皮质特异性AEG-1敲除小鼠的学习记忆和社会交互行为学进行初步评价。结果显示:成功获得子代基因型为AEG-1^fl/fl Cre⁺的基因敲除小鼠;AEG-1条件性敲除小鼠海马和皮质中AEG-1蛋白质表达水平较对照组显著降低;新物体识别结果表明AEG-1条件性敲除小鼠的区分系数明显低于对照组,表明AEG-1条件性敲除小鼠的学习记忆能力较弱,但是三腔交互结果表明AEG-1条件性敲除小鼠在社会交互上与对照组相比无明显差异。以上结果为AEG-1在学习认知方面的进一步研究奠定了基础。     

TACE与手术治疗原发性大肝癌的临床疗效比较

目的:比较经导管肝动脉化疗栓塞(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)和手术治疗原发性大肝癌(肿瘤最大直径≥5 cm)的临床疗效和安全性。方法:回顾性分析48例经TACE或手术(Operation)治疗的原发性大肝癌患者,其中TACE组25例,Operation组23例,治疗后随访24个月,评价和比较其治疗效果、生存曲线、镇痛剂的日平均用量及不良反应的发生情况。结果:治疗后3个月,TACE组患者的Karnofsky评分(P=0.033)显著高于Operation组,而血清甲胎蛋白(AFP)水平(P=0.022)显著低于Operation组。此外,TACE组的镇痛药杜冷丁的日均使用量显著低于Operation组(P=0.031),便秘的日均发生次数(P=0.045)显著少于Operation组。治疗后24个月,TACE组和Operation组的生存率分别为48.0%和17.4%,TACE组显著高于Operation组(P=0.0415,95%CI of ratio:1.006 to 1.994)。结论:TACE治疗原发性大肝癌的临床疗效可能优于手术治疗,且安全性高。     

复方蜥蜴散不同微粒组合剂对胃癌前病变模型大鼠Wnt信号通路中Wnt2、β-catenin、Cyclin-D1蛋白表达的影响

本研究采取MNNG综合因素制备GPL模型,分别用复方蜥蜴散80目制剂、100目、80+100目不同微粒等量混合剂、生理盐水、维酶素混悬液治疗,应用免疫组化法检测大鼠胃细胞中增值蛋白Wnt2、β-catenin、CyclinD1的表达,光镜观察胃黏膜病理组织学变化,并通过图像分析系统对免疫组化图像进行光密度的测算。结果显示:复方蜥蜴散80目、100目、80+100目不同微粒组合组细胞增殖基因Wnt2、β-catenin、Cyclin-D1蛋白的阳性表达率显著低于模型组(P0.01),复方蜥蜴散80+100目混合组三种蛋白的阳性表达率显著低于维酶素组(P0.05)。揭示了复方蜥蜴散可以修复损伤胃黏膜,治疗或逆转PLGC的发展,其作用机制可能是通过干预黏膜增生、分化,抑制细胞中Wnt2、β-catenin、Cyclin-D1过度增殖,促进细胞凋亡,恢复细胞增殖与凋亡的平衡,从而阻断胃癌前病变的。