酵母杂交系统在CRISPR/Cas9基因编辑系统脱靶率研究中的应用*

目的:为提高CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)靶向性奠定基础,同时证明酵母杂交系统在研究CRISPR/Cas9脱靶效应中的应用价值。方法:以实验室前期构建成功的activase基因编辑水稻株为研究对象,先采用T7核酸内切酶Ⅰ法初步预测30株基因编辑水稻株的脱靶率。随后以酵母杂交系统进一步预测脱靶率以及研究sgRNA结构对脱靶率的影响。首先,将activase靶向基因的标准sgRNA(standard sgRNA)和短sgRNA(truncated sgRNA)分别克隆至CRISPR/Cas9系统表达载体pDW3769中,构建对应的重组载体pHZ2和pHZ4,转化至YPH499酵母单倍体形成重组酵母YpHZ2和YpHZ4;其次,根据脱靶位点预测选择7组脱靶序列A、B、C、D、E、F、G以及靶向序列,分别克隆至包含报告基因mCherry的高拷贝载体pDW3133和低拷贝载体pDW3134,构建相应的高拷贝重组载体pHZ5、pHZ7、pHZ9、pHZ11、pHZ13、pHZ15、pHZ17和pHZ19,以及对应的低拷贝重组载体pHZ6、pHZ8、pHZ10、pHZ12、pHZ14、pHZ16、pHZ18和pHZ20,转化至YPH500酵母单倍体,构建重组酵母YpHZ5-20。随后,重组酵母YpHZ2和YpHZ4与重组酵母YpHZ5-20分别杂交,挑取双倍体酵母菌落,在不同的时间段下检测荧光数值,根据荧光值定量预测脱靶率。结果:酵母培养144~192 h时荧光最为显著,脱靶序列sgRNA与靶向基因sgRNA同源性越高,越易造成脱靶,但短sgRNA较标准sgRNA脱靶率低。根据水稻植株的脱靶检测显示脱靶率约20%,基于酵母杂交的检测结果显示脱靶率为20%~28%。结论:酵母细胞进入稳定期时荧光值最为显著,且与载体的拷贝数量成正比。sgRNA序列以及长短结构可影响CRISPR/Cas9的基因靶向性。两种方法的脱靶率预测结果相当,表明酵母杂交系统在评价CRISPR/Cas9系统的脱靶率以及研究脱靶影响因素中具有良好的应用价值。     

大豆(Glycine max(L.)Merr.)致敏蛋白Gly m Bd 30K检测方法及低致敏优异种质鉴定

Gly m Bd 30K蛋白是大豆中主要的免疫显性过敏原之一,会引起人和牲畜腹泻和肠道炎症等过敏反应。因此,发掘低Gly m Bd 30K蛋白含量优异种质对于培育优质大豆品种具有重要意义。为了获得致敏蛋白Gly m Bd 30K低含量的优异种质,根据Gly m Bd 30K蛋白的190-379aa多肽序列制备多克隆抗体;对来源于山西省的29份种质,利用Western blot技术对其Gly m Bd 30K蛋白含量进行检测;并扩增和分析Gly m Bd 30K基因序列;利用荧光定量PCR技术对筛选出的低Gly m Bd 30K含量种质进行表达分析。结果表明:从参试种质中鉴定出2份Gly m Bd 30K蛋白含量低的种质,Gly m Bd 30K蛋白低含量种质的鉴定效率为6.9%,分别是来自太原市的大豆种质134(ZDD02046)和大青豆(ZDD02174),其Gly m Bd 30K基因序列与Willams82相比,在启动子上都有TA重复序列变异,134(ZDD02046)有8次TA重复,大青豆(ZDD02174)有42次TA重复,表达分析结果显示,134(ZDD02046)的转录水平显著低于大青豆(ZDD02174),推测启动子上TA多态性可能影响了其转录水平。本研究建立Gly m Bd 30K蛋白含量测定的方法,鉴定出2份低蛋白含量的优异种质,为今后选育优质蛋白组合的大豆新品种提供了技术和材料支撑。     

利用电子鼻评价桃果实香气

为了明确不同桃品种资源果实香气差异,对桃果实香气评价和品质改良提供参考,本研究利用电子鼻系统对桃品种资源果实整果香气进行测定和区分。通过PEN 3.5电子鼻系统采集74份不同品种资源桃果实芳香成分并得到了不同传感器的响应值,采用主成分(PCA)、线性判别法(LDA)和负荷加载(LO)方法分析数据。LO分析结果显示,硫化氢(W1W)、氮氧化物类(W5S)、甲烷类(W1S)、芳香成分与有机硫化物(W2W)传感器对供试桃果实香气的评价起主要作用;结合PCA和区分度值表明白花水蜜、脆保、春冠、奉罐1号、菊黄和红肉桃1号与其他供试品种资源的香气区别较大;LDA可将不同果实生育期桃较好区分,长、中、短不同果实生育期桃甲烷类和芳香成分与有机硫化物传感器响应值差异显著(P<0.05);LDA可将硬肉类型(肉质绵)与其他4种肉质类型桃(不溶质、硬溶质、软溶质和硬质)区分开,且硬肉类型与其他4种肉质类型桃甲烷类传感器响应值差异显著(P<0.05);LDA无法区分不同肉色的桃,且各传感器响应值差异不显著。结果表明,生育期长短对桃果实香气有明显影响;硬肉类型桃香气较独特;不同肉色桃香气接近。     

甘肃省大豆品种生育期组的划分及地理分布研究

甘肃省地域广大,地形复杂,气候多样,大豆品种资源丰富,但甘肃各地大豆品种生育期生态类型并不明确。本试验以25份MG 0~Ⅴ的北美大豆生育期组标准品种为对照,将从甘肃各地收集到的151个大豆品种在甘肃境内5个生态区进行生育期性状鉴定和生育期组划分。结果表明,甘肃地区种植的大豆品种的生育期组在MG 00和MGⅥ之间。在所鉴定的品种中,属MGⅣ的比例(44.37%)最高,其次为MGⅤ(29.14%)、MGⅢ(11.26%)、MGⅡ(4.64%)、MG 0(3.31%)、MGⅥ(3.31%)、MG 00(2.65%)和MGⅠ(1.32%)。归属于MGⅢ的品种主要分布在河西灌区,占该区域参试品种总数的47.62%;归属于MGⅣ的品种主要分布在中部地区和陇东旱塬区,占中部地区参试品种总数的56.67%,占陇东旱塬区的63.83%;归属于MGⅤ的品种主要分布在陇南地区,占该区域参试品种总数的61.40%。根据甘肃不同地区可成熟的最晚熟大豆品种的生育期组与当地经度、无霜期建立回归方程,推断甘肃省大豆各生育期组的地理分布区间,提出了基于生育期组的甘肃省大豆品种引种方案,以期为甘肃地区大豆育种和品种布局提供科学依据。     

紫苏对医院绿地土真菌群落组成及生态功能群结构的影响

医院绿地土壤是医院人体病原真菌或潜在人体病原真菌重要的物种储存库。这些携带真菌孢子的土粒和灰尘在空气中的传播增加了医院院内真菌感染的风险,已成为一个日趋严重的公共卫生问题。现研究表明,不少高等植物,尤其是药用植物具很强的抗真菌特性。基于高通量测序及模拟盆栽试验,本研究观察了种植药用植物紫苏Perilla frutescens对医院绿地土壤真菌群落组成及生态功能群结构的影响。研究结果表明,医院绿地土壤真菌群落优势类群随紫苏生育期变化而发生明显变化。优势属由原初医院土（PTS）的绿僵菌属Metarhizium（60.94%）,依次变为紫苏生长期样本（GZS）的被孢霉属Mortierella（21.34%）、开花期样本（FZS）的亚隔孢壳科Didymellaceae中一未定属（47.22%）和枯萎期样本（WZS）的粪壳菌目Sordariales中一未定属（12.67%）。经FUNGuild平台对序列数据集作进一步解析发现,种植紫苏后能够驱动医院绿地土壤真菌生态功能群发生明显变化,一些分类单元由动物病原向腐生型和/或共生型生态功能群转变。动物病原菌群（包括人体潜在病原）相对丰度,由原初医院土（PTS）的61.36%,下调至紫苏生长期样本（GZS）的2.48%、开花期样本（FZS）的1.40%和枯萎期样本（WZS）的6.09%。研究揭示紫苏对医院绿地土壤真菌群落组成及相对丰度具有一定调控作用,尤其是可降低其中人体潜在病原相对丰度以减轻对人类健康的威胁,为引种药用植物增强医院绿地土壤健康水平及维护医院院内公共卫生安全提供了参考。     

丛枝菌根真菌对青杨抗溃疡病生物量和抗病酶活性的影响

本研究以青杨Populus cathayana 1年生扦插苗为试验材料,接种丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi,AMF）异形根孢囊霉Rhizophagus irregularis和杨树溃疡病菌聚生小穴壳菌Dothiorella gregaria,测定AMF对青杨根茎叶生物量,丙二醛（MDA）、脯氨酸和茎部纤维素含量,超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）、几丁质酶、多聚半乳糖醛酸酶和果胶甲基酯酶等抗病酶活性的影响。结果表明,接种AMF可以增加青杨根茎生物量,增加茎纤维素含量来增强树势,降低溃疡病发病率;接种AMF能够显著降低感病杨树茎部和根系MDA含量,增加叶片和根系脯氨酸含量,提高根茎叶PPO活性、茎SOD活性和叶片CAT活性;接种AMF前期可以提高茎和根系几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性,也可以提高叶片和茎多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶活性,接种病原菌条件下AMF效果更加显著。结论认为,AMF通过积累脯氨酸,降低MDA含量,提高SOD、CAT和PPO活性,增强杨树抗溃疡病能力;同时也可提高多聚半乳糖醛酸酶和果胶甲基酯酶活性来抑制病原菌菌丝的生长,减弱菌丝的扩展能力,增强杨树抗病性。     

少孢节丛孢中CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立及6-甲基水杨酸合酶新活性位点的发现

以捕食线虫真菌少孢节丛孢Arthrobotrys oligospora YMF 1.03170为研究材料,通过优化sgRNA 表达驱动体系 tRNA^Gly,构建CRISPR/Cas9基因编辑系统,成功获得基因定点编辑菌株。将该CRISPR/Cas9系统与同源重组相结合,可精确地对两个目的氨基酸编码基因同时进行定点置换。结合代谢图谱及前体化合物饲喂实验,发现6-甲基水杨酸合酶编码蛋白新的活性位点Arg17、Arg18、His33和His34。本研究将CRISPR/Cas9基因编辑系统应用在少孢节丛孢中,并成功建立基因编辑精细体系,为快速构建少孢节丛孢的遗传转化体系和研究该菌的基因功能提供有效方法。     

野生鸡油菌子实体可培养微生物多样性及其功能分析

采用多种培养基对采自贵州省贵阳市3个样地的鸡油菌Cantharellus cibarius子实体内细菌和真菌进行分离、培养、鉴定和多样性分析。利用FAPROTAX和FUNGuild数据库分别对其功能类群进行注释,从而探究微生物群对鸡油菌生长发育的影响。结果表明,鸡油菌子实体内共分离获得细菌49株,分属于2门、4纲、6目、9科、12属和27种,其中,优势属为假单胞菌属Pseudomonas;真菌90株,分属于3门、7纲、12目、26科、32属和44种,优势属为蜡蚧菌属Lecanicillium。功能分析结果显示,细菌主要集中于潜在氮代谢、芳香性气味物质代谢,以及难溶性化学物质的溶解等方面;真菌主要集中于分解复杂有机物、辅助菌根真菌与植物根系建立共生,以及潜在抑制虫害、病原菌侵染等方面。     

桑黄Zn(II)2Cys6锌簇蛋白转录因子及其在不同碳氮源条件下的表达

Zn(II)2Cys6锌簇蛋白转录因子（C6 zinc）在真菌次生代谢产物合成中发挥重要作用。本研究首先利用本地BLAST,从桑黄Sanghuangporus sanghuang全基因组中获得Zn(II)2Cys6锌簇蛋白转录因子编码基因,并利用生物信息学手段分析编码蛋白保守结构域、一级结构及二级结构,构建蛋白系统发育树,最后利用半定量PCR对它们在不同碳源和氮源培养条件下的表达情况进行检测。结果显示:从桑黄基因组中分析获得的11个Zn(II)2Cys6锌簇蛋白均具有Cy6型锌指基序,属于GAL4型锌簇蛋白转录因子;它们均为不稳定亲水性蛋白,具磷酸化修饰位点,糖基化修饰位点较少或没有,定位于细胞核中;其二级结构主要以无规卷曲和α螺旋为主;系统发育树分析结果显示,桑黄Zn(II)2Cys6锌簇蛋白分为2个大分支,其中Ⅰ类分支转录因子的保守结构域分布于蛋白N-端,Ⅱ类分支转录因子的保守结构域则分布于蛋白C-端;11个桑黄Zn(II)2Cys6锌簇蛋白转录因子在不同培养基培养的菌丝体中呈现差异化表达,其中,肌醇培养基和乳糖培养基能够有效促进大部分锌簇蛋白转录因子的表达;另外,基因簇分析显示桑黄锌簇蛋白SHCZ4可能是NRPS-PKS杂合基因簇体系的途经特异性转录因子。该结果将为桑黄次生代谢产物合成调控相关转录因子的研究以及潜在次生代谢相关基因簇的挖掘提供参考依据。     

绣球菌降血糖作用及活性成分分析

绣球菌是一种珍稀食药用真菌,本文对其醇提取物的降血糖作用及活性成分进行了研究。高脂高糖饲料联合链脲佐菌素造模建立了II型糖尿病小鼠模型,设置空白对照组、模型组、绣球菌提取物高、中、低3个剂量组（300、200和100mg/kg）,连续给予相应药物3周,对各组小鼠的体重、血糖、血脂和胰腺进行组织病理学研究。结果显示：与模型组相比,中高剂量绣球菌提取物组小鼠的体重增长减慢,绣球菌各剂量组小鼠血糖和胆固醇水平下降。根据病理学观察,经绣球菌提取物各剂量组处理后,小鼠胰岛细胞形态、数量和分布均显著改善,进一步证明了以上结果。利用UPLC-Triple-TOF/MS对绣球菌醇提物中的活性物质进行定性分析,从中鉴定出10种化合物,其中几种可能参与了机体糖代谢和脂肪代谢。研究结果为绣球菌的开发提供了理论依据和技术支持。