双歧杆菌对梗阻性黄疸大鼠肠道细菌移位影响的研究

目的观察梗阻性黄疸大鼠肠道细菌移位状况及经胃肠道给予双歧杆菌对肠道细菌移位的影响。方法Wistar大鼠30只随机分为3组：假手术组（SO组）、梗阻性黄疸组（OJ组）及双歧杆菌组。模型制备后第10天检测各组肝功能指标及血浆内毒素水平,取肝、脾、肠系膜淋巴结等肠道外器官组织行细菌培养,光镜观察末端回肠黏膜变化。结果 OJ组较SO组肝功能指标明显改变（P〈0．05）,双歧杆菌组肝功能指标较OJ组改善。SO组血浆内毒素水平为（0．26±0．22）EU／ml,OJ组内毒素水平为（1．99±0．31）EU／ml,较SO组明显升高（P〈0．01）,双歧杆菌组血浆内毒素水平为（0．74±0．20）EU／ml,较OJ组明显降低（P〈0．01）。OJ组肝、脾、肠系膜淋巴结中细菌移位率高于另两组,其中肠系膜淋巴结细菌移位率为90％,明显高于SO组及双歧杆菌组（P〈0．05）。光镜显示OJ组肠黏膜萎缩,绒毛水肿,部分上皮细胞脱落;双歧杆菌组肠黏膜上皮改变较OJ组明显减轻。结论梗阻性黄疸时出现明显的细菌移位与内毒素血症。应用微生态制剂可保护梗阻性黄疸时小肠黏膜屏障功能,减少肠源性细菌移位及内毒素血症的发生。     

气相色谱法测定液相合成蛋氨酸脑啡肽中杂质残留量

测定液相法合成蛋氨酸脑啡肽中三氟乙酸和醋酸的残留含量。应用气相色谱法,程序升温,离子火焰反应检测器,定量测定。结果可见,该法线性范围为0.001～0.08 mg/L,在此浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系,方法的检出限为0.0003～0.012 mg/L,测定的回收率为97.2%～101.7%,相对标准偏差<1.09%。所建立的检测方法简便,快速,灵敏度高,重复性好,可应用于检测蛋氨酸脑啡肽中残留醋酸的含量。     

蛋氨酸脑啡肽对免疫系统恢复作用的研究

采用固相合成法合成蛋氨酸脑啡肽,制备成注射液。对经放化疗后免疫系统受到伤害的晚期肿瘤志愿者进行治疗,经静脉滴注15 d。患者免疫系统指标全面迅速恢复,淋巴细胞亚群间比例趋于合理,证明蛋氨酸脑啡肽可以用于癌症患者的免疫系统的恢复治疗。     

人源CLP的表达、纯化及生化特性研究

目的：为进一步研究CLP（coactosin-likeprotein）与5’-脂氧合酶、肌动蛋白的相互作用机制及功能,开展CLP克隆表达、分离纯化研究,以得到高纯度的CLP,并对其生物化学特性进行分析测定。方法：从人的胎肝cDNA文库中经PCR扩增得到CLP基因,克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中并获得高效表达,经过Glutathione Sepharose 4B亲和层析和Su-perdex 75分子筛纯化,得到高纯度的CLP;在此基础上进行SDS-PAGE、动态光散射和分析型超速离心等实验,并进一步分析实验结果。结果：CLP在溶液中主要以单体形式呈现;CLP的摩擦率为1．909,证实该蛋白质具有线性化趋势存在的可能性,且线性化程度较高。结论：实验结果揭示了CLP作为线性化蛋白质的可能性,为进一步搭建CLP和丝状肌动蛋白的作用模型奠定了一定的数据基础。     

定量检测猕猴血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体间接ELISA法的建立

目的：建立定量检测血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体（HuMabs）NM57的间接ELISA法,为药代动力学研究提供一种简单快速的方法。方法：采用狂犬病毒糖蛋白包被酶标板、HRP标记的IgG-Fc段为标记抗体,建立定量检测HuMabsNM57的间接ELISA法,并对其特异性、灵敏度、精密度及准确度进行检测。结果：间接ELISA法检测HuMabsNM57的灵敏度为5ng／mL,组内及组间精密度分别为2．6％-6．0％、8．5％-11．3％。结论：建立了灵敏度高、特异性强的检测HuMabs NM57的间接ELISA法,精密度及准确度均符合药代动力学要求,可用于猕猴及人血清中HuMabsNM57的检测。     

以gfp为报告基因的肺炎链球菌启动子诱捕文库的构建与分析

首先构建一个以gfp(green fluorescence protein)为报告基因的自杀质粒pEVP3-SDGFP,将肺炎链球菌基因组DNA的随机酶切片段(200bp～800 bp)克隆到该质粒gfp基因上游的多克隆位点,得到约58000个含有肺炎链球茵基因组DNA随机酶切片段的重组子,提取质粒即为质粒库,该库大约覆盖肺炎链球菌基因组全长的5倍,插入率达到90%以上,且有较强的随机性,质量较高.将该质粒库转化入肺炎链球菌TIGR4菌株,带有随机片段的报告质粒通过同源重组的方式将gfp基因融合于细菌染色体上该随机片段之后,利用质粒的抗生素抗性基因筛选出重组菌株,从而构建出相应的菌株库,共获得包含约500000个肺炎链球菌转化子的菌株库,经体内、外实验表明,其包含插入了S.pn体内、外表达基因片段的细菌,可以报告特定条件下的基因表达,并可通过流式细胞仪识别、分选.该文库的构建为进一步利用差异荧光诱导技术筛选肺炎链球菌体内诱导基因奠定了基础.     

植酸酶phyAm基因结构延伸突变改善酶的热稳定性

将来源于黑曲霉N25的植酸酶基因phyA^m重组于大肠杆菌表达载体pET-30b（＋）,以重组表达载体pET30b-FphyA^e为模板经PCR扩增获得结构延伸突变植酸酶基因phyA^m（在植酸酶基因C端增加了来源于pET-30b-FphyA^m载体上13氨基酸残基）。含突变基因的重组表达载体pPIC9k-phyA^e在GS115酵母中表达。纯化的突变酶pp-NP^e与野生型酶PP-NP^m-8相比：PP-NPA^e的最适反应温度上升了3气,75℃处理10min,热稳定性提高21％,比活力略有提高。最适反应pH为5．6,有效pH范围pH4,6到pH6．6。比未突变酶扩大了0.4单位。     

人类新基因WDR70的克隆及初步研究

运用基于基因组数据库的特定基因同源新基因的克隆策略得到一个人类新基因WDR70 ,该基因编码一个包含 12个WD4 0结构域的蛋白。WDR70的cDNA序列长 2 2 6 6bp ,预测编码蛋白含 6 30个氨基酸 ,理论分子量为 70× 10 3 u ,染色体定位为 17p13.1。以小鼠胚胎为模型进行整体原位杂交 ,结果显示WDR70基因在 8.5d小鼠胚胎中没有表达 ,而在 9.5d和 10 .5d的小鼠胚胎的脑部有特异表达。由此推断该基因对胚胎期脑部的发育有重要的影响。     

无饲养层培养人胚胎干细胞方法的建立

人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hES细胞)是当前医学研究的热点之一．然而hES细胞培养条件苛刻,通常需要采用鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEFs)饲养层来维持其未分化状态,成为目前hES细胞研究的瓶颈之一、本实验成功地将hES细胞接种在细胞外基质包被的六孔板上培养,传代20次后细胞仍然保持良好的未分化状态,各种hES细胞生物学特性(如表面标志物SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-8l,OCT-4,碱性磷酸酶及体内外分化潜能等)均无改变;其冻存、复苏效果与生长在饲养层上的hES细胞无明显差异．因此,该无饲养层培养体系可以用于培养hES细胞,并为hES细胞转基因研究及大规模培养打下良好的基础．     

F43Y及I354M,L358F定点突变对植酸酶热稳定性及酶活性的改善

对重组酵母PPNPm8的植酸酶phyAm基因进行PCR介导的定点突变,即将植酸酶43位的苯丙氨酸替换为酪氨酸(F43Y),将其354、358位的异亮氨酸、亮氨酸分别替换为甲硫氨酸和苯丙氨酸(I354M,L358F),得到了2个突变体PPNPm-1(F43Y)及PPNPm-2(I354M,L358F).含突变基因的重组表达载体pPIC9kphyAm-1,pPIC9kphyAm-2在毕赤酵母GS115中表达,对表达产物进行酶活性测定及热稳定性检测.结果表明:突变体PPNPm-1最适反应温度比未突变体PPNPm8上升了3℃,75℃处理10min,热稳定性提高15%,比活力提高11%;PPNPm-2最适反应温度未改变,热稳定性比PPNPm8仅提高3%,比活力降低6.5%.对突变前后的植酸酶空间结构进行比较预测,发现突变氨基酸Tyr43与空间位置相邻的Asn416之间形成氢键,增强了酶的热稳定性.