赭曲霉11α羟化酶的克隆表达及关键氨基酸位点分析

11α,17α-双羟基黄体酮是甾体激素类药物的重要中间体,工业上主要利用霉菌对17α-羟基黄体酮的11α羟化反应制备。对赭曲霉的11α羟化酶及其关键氨基酸位点展开研究,为深入解析酶的催化机理提供基础数据。利用底物转化实验探究了10个羟化反应常用霉菌对17α-羟基黄体酮的转化能力,考察了赭曲霉来源的11α羟化酶CYP68J5在不同表达系统中的活性,借助结构预测、分子对接和定点突变等手段对CYP68J5的关键氨基酸位点进行解析。结果表明,赭曲霉的转化能力最强,转化时间60 h的摩尔产率达到最大值,为78.55%;其羟化酶CYP68J5在酿酒酵母中的表达活性最高;位于底物结合口袋附近的D118、F216、M488是CYP68J5的关键氨基酸位点,这些位点在维持酶的结构稳定性上发挥重要作用,是后续分子改造的潜在重要靶点。     

麻疹病毒L4株血凝素基因的克隆与表达及免疫原性

从部分减毒的麻疹病毒Ｌ４株感染的Ｖｅｒｏ细胞中提取ｍＲＮＡ,进行逆转录及ＰＣＲ扩增,克隆到了长１．９ｋｂ的４个血凝素基因克隆,ＤＮＡ序列分析发现,Ｌ４株的血凝素甘因有４个碱基与Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株不一致。造成了３个氨基酸差异,这４个克隆在重组痘苗中的表达后,３个克隆的表达产物均表现出良好的血凝活性,助融合活性（Ｆｕｓｉｏｎｈｅｌｐｅｒ）和较强的免疫原性,表达血凝素分子量分别为未糖化的６８ｋＤ以及糖     

固氮螺菌的血清学研究——Ⅰ.固氮螺菌的血清学分类

本实验采用玉米、谷子、水稻、甘蔗和小麦的根表上分离获得具有较高固氮酶活的细菌61株,根据其形态特征及生理生化特性,将61株固氮螺菌归属于Azospirillum属Azospirillum brasilense种,同时根据它们还原硝酸盐和亚硝酸盐的明显差异分为两群:第一群(a)具有硝酸盐和亚硝酸盐还原酶,不累积亚硝酸盐产生     

小瓶菌属的两个新种和一个新变种

从我国广东和云南两省的土壤中分离出6株放线菌,通过形态、培养特征、生理生化特性及细胞壁组份等的研究,证明为游动放线菌科小瓶菌属中的两个新种和一个新变种：筒状小瓶菌(Ampullariella cylindrica n. sp.)、生毛小瓶菌(Ampullariella pilifera n. sp.)和生毛小瓶菌海南变种(Ampullcriella pilifera var. hainanensis n. var.)。     

生孢囊放线菌及其它属菌的甲基萘醌

用高压液相层析对31个属90株生孢囊放线菌及其它属菌的甲基萘醌进行了测定。其结果表明：游动放线菌属．小瓶菌属和小单孢菌属的甲基萘醌为MK-9(H4)MK-10(H4),无定形孢囊菌属和游动单孢菌属的甲基萘醌为MK-9(H4),指孢囊菌属的甲基萘醌为MK-9(H8)MK-9(H4),链孢囊菌属的甲基萘醌为MK-9(H4)或MK-9(H6),螺孢菌属的甲基萘醌为MK-9(H6)MK-9(H4),游动双孢菌属的甲基萘醌为MK-9(H2)MK-9(H4)。不同放线菌属的甲基萘醌组份是较稳定的,可作为属的分类特征之一。建议用甲基萘醌与形态和细胞壁化学组份相结合区分放线菌中的不同属。     

臭曲霉(Aspergillus foetidus)启动子H8片段克隆及其序列

使用原核及真核菌通用的挑选启动子克隆载体pJGI,从臭曲霉菌体总DNA中分离到具有较好活性的启动子H8片段。根据Southern blot证明该启动子来自臭曲霉菌;H8全片段DNA序列分析结果表明其含有7 50bp,内含典型真核启动子功能序列(TA TA box)及增强子GTGG：TTTAAAG的相似序列,分析证实是一个新的臭曲霉启动子。初步实验表明该启动子不但在臭曲霉菌内有启动功能;并第一次证明来自臭曲霉菌的启动子在原核细胞中也具有启动子活性,能够表达完整的Lacz基因。     

流行性感冒病毒重组的研究II．温度敏感母株的选育与性质

从甲3／夏防72-II野毒株中经终末传代选出了自然突变的ts株——夏原ts,其切断洞度为≤38℃。在地鼠肺中繁殖能力显著降低,但在小鼠中仍能保护野毒的攻击,其遗传性较为稳定。用夏原ts与灭活的甲2／福流58-8野毒重组,成功地选出了福Ri、福R2与福R3三株重组ts病毒,其切断温度与遗传稳定性与夏原ts相似。福Rl的血凝素和神经氨酸酶均与福流58.8相同,福R2与福R 3血凝素与福流58.8相同,但神经氨酸酶则与夏原ts相同。用福R 3活毒作为母株与不同年代流行的甲,型变种的灭活病毒重组选育ts疫苗株。在选出的6株{燕苗株中{株反应性及免疫原性均较好,2株免疫原性较差,特别是与甲,型最近一个变种粤防77—38重组选出的疫苗株的免瘦原性很差。对我们的重组选育方法的特点,如应用自然ts母株,活毒一死毒重组和在鸡胚中选育进行了讨论,并提出了存在的问题和改进的方向。     

基因编辑动物模型在人类疾病研究中的应用

近年来,随着以CRISPR/Cas9为代表的多种CRISPR系统的开发和不断改进,基因编辑技术逐渐完善,并广泛应用于人类疾病动物模型的制备。基因编辑动物模型为人类疾病的发病机理、病理过程以及预防和治疗等方面的研究提供了重要的素材。目前,用于人类疾病研究的基因编辑动物模型主要有小鼠、大鼠为代表的啮齿类动物模型和以猪为代表的大动物模型。其中啮齿类动物在机体各方面与人类差别较大,且寿命短,无法对人类疾病的研究和治疗提供有效评估和长期追踪;而猪在生理学、解剖学、营养学和遗传学等各方面与人类更接近,是器官移植和人类疾病研究领域重要的动物模型。文中主要介绍了基因编辑动物模型在神经退行性疾病、肥厚心肌病、癌症、免疫缺陷类疾病和代谢性疾病等5种人类疾病研究中的应用情况,以期为人类疾病研究及相关动物模型的制备提供参考。     

人源溶菌酶在大肠杆菌中的表达与复性研究

人源溶菌酶(Human lysozyme,HLZ)是一种糖苷水解酶,具有抗菌消炎的作用,其作为抗生素的替代品,已经被广泛应用于食品业、畜牧业和医疗等领域。如何获得高产量、高活性、高纯度的人源溶菌酶一直是亟待解决的技术问题。优化人源溶菌酶编码基因密码子,提高其在大肠杆菌中的适应度和表达量;将优化的基因克隆至大肠杆菌表达质粒pET21a,并将其在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中诱导表达;利用8 mol/L尿素溶液对包涵体进行溶解变性后,探究一步透析、梯度透析和梯度稀释3种复性方式以及复性液中谷胱甘肽氧化还原对(GSSG/GSH)、精氨酸、甘油等复性物的浓度对重组人源溶菌酶复性的效果,获得最佳的复性方案。研究结果表明:37℃诱导温度下,利用0.5 mmol/L IPTG成功诱导了分子量约为14.7 kD的重组人源溶菌酶的表达,包涵体表达量约为380 mg/L(湿重)。包涵体经一步透析、梯度透析和梯度稀释3种复性方式复性后,测得比活力值分别为147 U/mg、335 U/mg、176 U/mg,表明最佳复性方法为梯度透析复性法。进一步探索了复性液中GSSG/GSH比值、精氨酸浓度、甘油浓度对人源溶菌酶复性效果的影响,表明当复性液中同时添加浓度比为1∶2的GSSG/GSH、4 mmol/L精氨酸和6%甘油时,复性后人源溶菌酶的最佳比活力值为1170 U/mg,显著高于3种复性物均不加时溶菌酶335 U/mg的比活力值,但低于溶菌酶标准品1732 U/mg的比活力值。成功地将人源溶菌酶基因在大肠杆菌中表达,并通过包涵体复性体系成功获得高活性重组人源溶菌酶。