反向遗传学技术在疫苗研究的进展

本文通过反向遗传学技术的基本原理,发展历史和反向遗传学技术在疫苗研究方面的进展与应用,重点介绍了反向遗传学技术在流感病毒疫苗方面的应用。     

三种石杉属植物孢子形态的扫描电镜观察

利用扫描电镜对采自湖北省利川市的蛇足石杉Huperzia serrata（Thunb.ex Murray）Trev.、皱边石杉H.crispate（Ching ex H.S.Kung）Ching和四川石杉H.sutchueniana（Herter）Ching3种植物孢子的大小、形态及表面纹饰等方面进行观察测量,并对每个种孢子形态特征进行了描述。结果表明,3种石杉属植物孢子均为四面体型、三裂缝、辐射对称,表面纹饰均呈穴状。不同种在孢子大小、裂缝长度、孔穴深浅程度以及辐射间区凹陷程度上存在差异。因孢子形态是稳定的,可作为种间划分的重要依据,同时,也为蕨类植物孢子形态学的研究提供参考。     

基于颜色判定的环介导逆转录等温扩增技术检测人甲型H1N1流感病毒基因

建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的检测方法,即环介导逆转录等温核酸扩增技术(RT-LAMP)应用于人甲型H1N1流感病毒基因检测。该技术使用对应于人甲型H1N1流感病毒HA序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下(65℃)进行核酸扩增反应1.5h,在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,以HNB的颜色变化做为结果判定标准并经琼脂糖凝胶电泳验证。文中利用这种技术对不同来源及亚型的流感病毒进行了特异性分析,对体外转录的人甲型H1N1流感病毒HA基因RNA的系列稀释物进行了灵敏度分析,成功检测美国CDC提供的人甲型H1N1流感病毒标准品,利用RT-LAMP和RT-PCR同时检测了30份人甲型H1N1和26份季节性流感咽拭子标本。结果显示RT-LAMP方法特异性高,灵敏度可达到60个拷贝RNA分子水平,对临床标本的检出率与常规RT-PCR法相当,利用650nm的比色分析通过标准曲线可以实现对样品的定量。因此,基于颜色判定的环介导逆转录等温扩增方法可用于人甲型H1N1流感病毒感染的快速筛选,具有在基层疾病预防控制中心流感监测网络实验室和哨点医院推广和应用的潜力。     

同时检测新甲型H1N1及人季节性H1N1和H3N2流感病毒的单管多重荧光定量PCR方法

本研究设计的一种4重荧光定量RT-PCR检测方法,以A型流感病毒各亚型的血凝素基因(HA)为检测靶标,实现了同时检测新甲型H1N1流感病毒、人季节性H1N1流感病毒和人季节性H3N2流感病毒。本法使用人细胞RNA酶P基因作为内参,以判断标本来源和实施质量控制。利用不同来源和亚型的流感病毒验证了该方法的特异性;利用连续稀释的新甲型H1N1流感病毒HA全基因体外转录物进行灵敏度分析。结果表明该方法灵敏度高,可检测低至20个拷贝的RNA;特异性强,每对引物只检测出对应的病毒,无交叉反应;并且成功地验证性检验了34份新甲型H1N1流感病毒阳性临床标本和20份人季节性H1N1和H3N2流感病毒及人乙型(HB)流感病毒阳性临床标本。因此,该多重荧光定量RT-PCR法是一种可同时检测2009年新甲型流感病毒及季节性流感病毒的有效方法。     

核桃扁叶甲淡足亚种的生活习性和防治方法

<正> 漾濞县是全国著名的核桃产区之一,年产量350多万斤。历史上核桃扁叶甲淡足亚种Gastrolina depressa pallipes Chen曾多次猖獗成灾,1979年受灾面积达2万余亩,不仅造成核桃减产,而且由此引起天牛等次期性害虫浸入,致使一些大树枯死。1978年以来,我们对此虫作了观察和研究。 一、形态特征 成虫 体长5.3—7.1毫米,宽2.8—3.9毫米。鞘翅紫铜色或青蓝色,具有粗大点刻,纵列于翅面,有纵走棱纹,翅基部两侧较隆起,边缘有折缘。前胸背板的前后角和侧缘为棕黄色。足淡黄色,股端、胫基及跗节黑色。 卵 长卵圆形,长1.3—1.5毫米,粗0.6毫米,初产为乳白色,后至淡黄白色,顶端透明发亮。     

2009～2013年我国活禽市场环境样本中禽流感病毒的检测

为了解中国活禽市场环境样本中禽流感病毒分布情况,对全国2009~2013年采自活禽市场的环境样本进行流感病毒核酸检测,并利用无特殊致病原鸡胚(SPF鸡胚)对A型流感病毒核酸阳性标本进行病毒分离。结果显示,环境标本中禽流感病毒核酸阳性率的波动呈明显的季节性趋势,冬春季节核酸检测阳性率较高;我国南方地区活禽市场环境样本的禽流感病毒核酸阳性率高于北方。市场中清洗禽类的污水和宰杀或摆放禽肉案板表面的擦拭样本核酸阳性率高于其它类型的样本。2009~2013年环境样本中分离到的禽流感病毒以H5和H9亚型为主,2013年之前H5亚型多于H9亚型,而2013年H9亚型超过了H5亚型。本研究表明,对城乡活禽市场中禽流感病毒的实时监测具有重要的公共卫生意义,可为我国人感染禽流感病毒的防控和预测预警提供依据。     

美国白蛾热激蛋白70基因的鉴定及功能分析

【目的】探究热激蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)基因在美国白蛾Hyphantria cunea抵御高温胁迫过程中的作用,为揭示美国白蛾的扩散机制以及预测潜在分布区提供理论支撑。【方法】利用PCR技术克隆美国白蛾HSP70基因,并进行生物信息学分析;利用qPCR技术检测新蜕皮的美国白蛾4龄第2天幼虫在25, 30, 35和40℃处理下HSP70基因的表达特性;构建美国白蛾HSP70的原核表达载体,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21感受态细胞中诱导表达该蛋白,利用Ni²⁺-His柱纯化蛋白,并通过Western blot验证该蛋白;利用体外实验测定原核表达获得的重组蛋白在高温胁迫下的ATP酶活性。【结果】克隆获得美国白蛾2条HSP70基因HcHSP70(GenBank登录号: MT995848)和HcHSC70(GenBank登录号: MT261583),其ORF长度分别为1 917和2 061 bp,分别编码637和687个氨基酸,分子质量分别约为69.66和74.96 kD,等电点分别为5.90和5.96;氨基酸序列结构均含有3个高度保守的区域GIDLGTTYS, IFDLGGGTFDVSIL和VGGSTRIPKVQ,符合热激蛋白70家族的特征;蛋白三维结构均由N端ATPase功能域和C端底物结合功能域所组成。系统进化树显示HcHSP70与鳞翅目HSP70家族其他成员聚为一支,而HcHSC70与鳞翅目HSC70家族的其他成员聚为另一支。qPCR结果表明,新蜕皮的美国白蛾4龄第2天幼虫在热胁迫下HcHSP70的相对表达量显著上调,且在35℃处理2 h下达到峰值,而热胁迫下HcHSC70的表达响应较微弱。成功构建了HcHSP70的原核表达载体并在体外诱导表达。纯化后的重组蛋白HcHSP70具备ATPase活性,且在高温胁迫下酶活性稳定。【结论】本研究克隆获得美国白蛾2条HSP70基因HcHSP70和HcHSC70,明确了两条基因在高温处理下的表达特性;成功对美国白蛾HcHSP70进行原核表达及纯化,并证明重组蛋白HcHSP70在高温下具有稳定的ATPase活性,推测其在美国白蛾应对高温胁迫中发挥着重要作用。     

流感病毒H3N2血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达

克隆、表达和鉴定流感病毒H3N2 HA,NA基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。在成功克隆流感病毒H3N2全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a(+)上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a(+)/HA(截短),pET32a(+)/NA(截短),pGEX4T-1/HA,转化大肠杆菌BL21/Rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱和GSTrap 4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果显示,重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致。ELISA和Western blotting试验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。成功克隆和表达了流感病毒H3N2 HA、NA基因序列,可为流感病毒H3N2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供参考。