流感病毒H1N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在酵母菌中的表达

在成功克隆流感病毒H1N1全长HA(Hemagglulinin,HA)、NA(Neuramidinase,NA) 基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMETA上,构建了重组表达质粒pMETA/HA(52~1 557 bp)、pMETA/NA(121~1 263 bp),电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。SDS-PAGE显示重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,蛋白纯度占总蛋白的95％以上,ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。成功克隆和表达了流感病毒H1N1 HA、NA基因序列,为流感病毒H1N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供了参考。     

禽流感病毒H5N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达

目的：克隆、表达和鉴定禽流感病毒H5N1血凝素基因（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶基因（neuramidinase,NA）序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法：在成功克隆禽流感病毒H5N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a（＋）上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a（＋）/HA(49~1587bp)、pET32a（＋）/NA(121~1141bp)、pGEX4T-1/HA、pGEX4T-1/NA,转化大肠杆菌BL21/rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2＋亲和层析柱和GSTra P4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果：重组蛋白在大肠杆菌中可以高效达,SDS PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,蛋白纯度占总蛋白的90％以上。ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论:成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 HA、NA基因序列,为禽流感病毒H5N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。     

基于微滴式数字PCR技术的甲型流感病毒绝对定量方法的建立及应用北大核心CSCD

数字PCR(Digital PCR,dPCR)是核酸绝对定量的新方法,然而,基于dPCR的甲型流感病毒(Influenza A virus,FluA)绝对定量方法还未系统建立。本研究首先对微滴式dPCR的退火温度进行了梯度优化,确定了dPCR反应的最佳退火温度为64.4℃;利用FluA核酸标准品,确定了微滴式dPCR对FluA的检测范围为37.7~8.22"104拷贝/#L,检测的检出限为3.77拷贝/反应。微滴式dPCR的检测结果与标准品拷贝数的相关系数为R2=0.9988,提示该方法检测结果具有较高的可信度。用建立好的微滴式dPCR方法可对待测临床样本中的FluA进行了拷贝数定量。因此本研究建立了基于微滴式dPCR的FluA绝对定量方法,可有效地对临床样本中甲型流感病毒载量进行绝对定量,为临床研究中病毒载量的测定提供了一种技术。     

基于微滴式数字PCR技术的甲型流感病毒绝对定量方法的建立及应用

数字PCR(Digital PCR,dPCR)是核酸绝对定量的新方法,然而,基于dPCR的甲型流感病毒(Influenza A virus,FluA)绝对定量方法还未系统建立。本研究首先对微滴式dPCR的退火温度进行了梯度优化,确定了dPCR反应的最佳退火温度为64.4℃;利用FluA核酸标准品,确定了微滴式dPCR对FluA的检测范围为37.7~8.22"104拷贝/#L,检测的检出限为3.77拷贝/反应。微滴式dPCR的检测结果与标准品拷贝数的相关系数为R2=0.9988,提示该方法检测结果具有较高的可信度。用建立好的微滴式dPCR方法可对待测临床样本中的FluA进行了拷贝数定量。因此本研究建立了基于微滴式dPCR的FluA绝对定量方法,可有效地对临床样本中甲型流感病毒载量进行绝对定量,为临床研究中病毒载量的测定提供了一种技术。     

中国首次检出的H12N2亚型禽流感病毒的基因组特征和系统进化分析

本实验室自2011年开始在鄱阳湖周边地区开展家禽养殖户和活禽市场环境中的禽流感病毒监测,在2011~2016年的监测过程中,通过病毒分离和深度测序,发现了一株H12N2亚型禽流感病毒,这是在中国首次检出该亚型病毒。该标本来自一份鸭粪便标本,采集自江西省余干县的一个家禽养殖场。病毒的8个片段分别与来自鸭或者野禽中的病毒最为接近。对病毒的全基因组系统进化分析表明,该病毒属于欧亚谱系。HA蛋白裂解位点序列为PQAQDR/GLF,属于低致病性禽流感病毒,受体结合位点分析表明病毒对α-2,3唾液酸受体亲和力较好。病毒NA的茎部没有氨基酸的缺失,但是PB1蛋白的L13P和L473V可以增强病毒聚合酶在哺乳动物中复制的能力和病毒对于哺乳动物的毒性。M1蛋白N30D突变和T215A突变提示会增加流感病毒对于哺乳动物的致病性。本次从家禽养殖场环境中检出野鸟相关的禽流感病毒进一步说明了在该地区进行禽流感病毒监测的重要性,以及在家禽-野鸟界面加强生物安全措施的必要性,需要持续进行监测,为禽流感病毒的暴发提供预警,为人感染禽流感病毒提供风险评估的依据。     

中国肯氏兽-山西鳄组合带的新发现之三:山西临县的主龙型类

近几十年,华北的二马营组上部地层以产出中国肯氏兽-山西鳄四足动物化石组合而闻名.最近在山西临县白道峪于上覆的铜川组一段发现了中国肯氏兽.本文描述了同一地点同一层位产出的主龙型类化石,包括一具山西鳄的部分骨架以及一些可以归入suchian的主龙类.它们是铜川组一段首次记述的主龙型类.最有鉴定特征的suchian材料包括一个大的髂骨以及一个小的、形状很奇特的、可能是跟骨的骨骼.髂骨可能可以归入一个奇异的波波龙类(poposauroid).因为中国肯氏兽与山西鳄同时出现在白道峪,表明中国肯氏兽-山西鳄组合可以向上延伸到铜川组一段.髂骨与跟骨大小悬殊,可能代表两个从未在中国肯氏兽-山西鳄组合报道过的物种.白道峪发现了特化的波波龙类,支持了波波龙类在中三叠世大量分化的观点.     

新冠病毒变异株的流行现状及其生物学特征

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）疫情在全球持续传播,至今已经演化出多种新冠病毒变异株。关切变异株（Variants of Concern,VOCs）和关注变异株（Variants of Interest,VOIs）具有不同的生物学特性、传播力和致病力,现有疫苗对不同变异株的保护作用以及检测试剂的效能成为公共卫生的关注点。应该建立全球的监测体系,不断跟进变异株对检测效力、疫苗效能及药物作用的影响,及时对防控策略进行调整。     

利用马赛克策略设计靶向神经氨酸酶抗原的广谱流感疫苗

季节性流感病毒仍对全球公共卫生安全构成巨大威胁，对老人、儿童以及免疫功能低下人群的危害尤其严重。疫苗接种是目前应对季节性流感疫情重要手段，然而由于抗原转换和抗原漂移，常出现疫苗株与实际病毒流行株的不匹配现象，因此迫切需要开发一种安全高效的广谱流感疫苗来对抗季节性流感病毒和潜在的流感大流行。抗原设计是研发新型疫苗的关键前提，我们利用马赛克（mosaic）遗传算法设计研发了一种具有广谱抗原表位覆盖率的靶向流感病毒神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）的新型抗原（Mosaic-NA）。该抗原在最大程度上涵盖了所有已报道甲型流感病毒的NA1蛋白与NA2蛋白序列中的细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）抗原表位，并保留了天然蛋白空间构象。因此，这种新型抗原预期可有效诱导出靶向保守表位的CTL反应和抗体反应，从而为研发通用流感疫苗提供新思路和理论基础。