酵母转录因子PHO81基因的上游序列功能分析

利用ＰＨＯ８１ｌａｃＺ融合基因,对它的上游进行缺失分析,发现有两个区域对ＰＨＯ８１基因的表达是必需的：－４０１～－２８９ｂｐ和－１０１２～－８０１ｂｐ。比较ＰＨＯ８１和ＰＨＯ５,ＰＨＯ８４基因上游,未发现有较高同源性的序列存在,但在－４０１～－２８９ｂｐ区域有ＰＨＯ４蛋白结合位点的核心序列５′ＣＡＣＧＴＧ／Ｔ３′,以及ＣＡＣＧＴＧ／Ｔ两侧富含Ａ／Ｔ的序列（可能是ＰＨＯ２结合位点）。推测－４０１～－２８９ｂｐ包含了ＰＨＯ８１的上游激活序列（ＵＡＳ）,－１０１２～－８０１ｂｐ可能起增强的作用。用酵母总蛋白质对－１０１２～－８０１ｂｐ进行凝胶阻抑电泳分析,证明有未知的蛋白因子结合在这个区域。     

PHO4和PHO2蛋白与PHO81基因调控序列的相互作用

高效表达产纯化了ＰＨＯ４和ＰＨＯ２蛋白,凝胶阻抑电泳分析证明了ＰＨＯ４和ＰＨＯ２蛋白与ＰＨＯ８１上游－４０１－２８９ｂｐ片段的结合,定点突变ＰＨＯ２的２３０位丝氨酸为天冬氨呈丙氨酸,不影响ＰＨＯ２蛋白与此片段的结合。足迹法分析证明了ＰＨＯ４结合在ＰＨＯ８１基因上游的３５４－３３３ｂｐ,ＰＨＯ２结合在３４１－３３４ｂｐ。因此,这些结果表明－４０１－２８９ｂｐ包含了ＰＨＯ８１的上游激活序列（ＵＡＳ）,     

猪卵母细胞玻璃化冷冻后细胞骨架的变化

为研究玻璃化冷冻后猪卵母细胞纺锤体、染色体和微丝的变化，从屠宰猪卵巢表面直径2—5 mm卵泡中采集未成熟(GV)期卵母细胞，由GV期卵母细胞经成熟培养获得体外成熟(MⅡ)期卵母细胞。GV期和MⅡ期卵母细胞各分为3组：对照组、冷冻保护剂处理组和玻璃化冷冻组。MⅡ期卵母细胞经分组处理后直接用于激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察样本；而GV期卵母细胞处理后先经44 h成熟培养，再用作LSCM观察样本。供试卵母细胞经固定、免疫荧光染色后，于LSCM下观察。结果表明，冷冻保护剂处理组GV期卵母细胞经成熟培养后，其纺锤体结构、染色体排列与微丝分布正常率分别为42.9%、89.6%和28.6%；玻璃化冷冻组此3项指标的正常率分别为10.1%、36.4%和16.9%，两组间差异显著(P<0.05)；除冷冻保护剂处理组染色体正常率与对照组无较大差异外，两试验组的其他指标均明显低于对照组(分别为79.5%、93.1%和72.3%，P<0.05)。MⅡ期卵母细胞冷冻保护剂处理组的纺锤体结构、染色体排列与微丝分布正常率分别为34.4%、61.3%和47.9%，而冷冻组分别为12.9%、56.7%和37.2%，两组均显著低于对照组(分别为78.3%、90.1%和72.8%，P<0.05)。结果表明，猪GV期和MⅡ期卵母细胞经冷冻保护剂处理或玻璃化冷冻保存后，均造成了纺锤体、染色体和微丝不可逆的损伤，这可能是影响卵母细胞成熟、受精与发育的重要原因。     

习惯化用药及其策略转换的神经环路调控机制

目标导向和习惯化行为策略转换缺陷是习惯化觅药行为形成的主要原因.以往认为,前额叶皮层对负责目标导向系统的背内侧纹状体控制能力的减弱介导了习惯化行为.然而,最新研究发现,背外侧纹状体(DLS)的直接通路和间接通路可选择性调控目标导向和习惯化系统.并且,运动皮层对DLS的投射可通过双向调节多巴胺D1受体(D1DR)和D2受体(D2DR)神经元突触可塑性,调控直接通路和间接通路间的协同或拮抗作用.近期研究还发现,杏仁核作为调控情绪的关键脑区,可通过中央杏仁核与基底外侧杏仁核间的功能迁移,从而介导习惯化觅药行为中伏隔核与DLS间的功能连接.此外,纹状体内D1DR和D2DR神经元对习惯化觅药行为的调控存在竞争关系.鉴于此,本文将重点讨论伴随习惯化用药形成发生行为策略转换缺陷相关的细胞特异性和环路特异性的脑功能异常机制.     

人软骨细胞压力实验模型的建立与评估

目的:人承重关节内受到的多种机械应力(剪切力、张力、静水压力等)在调节关节软骨细胞的生理功能方面起着重要作用。建立对人膝关节软骨细胞施加不同强度周期性静水压的压力模型,观察不同压力强度下软骨细胞的生长形态、增殖和凋亡情况。方法:采用酶消化法分离培养正常成人膝关节软骨细胞,将培养的第3代软骨细胞分为6组:对照组、0.5 MPa组、1.0 MPa组、3.0MPa组、5.0 MPa组、8.0 MPa组,应用高压恒温静水压加载系统分别给予各组不同强度压力作用5 d,每日1 h。甲苯胺蓝染色法和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色法鉴定软骨细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态和生长状况,流式细胞术检测细胞凋亡,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线。结果:与对照组相比,0.5 MPa、3.0 MPa组无明显差异(P0.05);1.0 MPa组能促进软骨细胞增殖,抑制凋亡(P0.05);5.0 MPa组出现细胞增殖能力下降,细胞活力降低,凋亡率增加(P0.05);8.0 MPa组则表现出明显的细胞增殖的抑制和细胞凋亡趋势(P0.05),以及细胞形态学的改变。结论:不同强度的周期性压力对人软骨细胞的新陈代谢产生了不同影响,尤其在软骨细胞的增殖和凋亡水平方面。利用本压力实验模型能体外模拟人负重关节软骨细胞的受压情况,初步确定了人软骨细胞压力实验中压力梯度的选择。为软骨细胞的压力损伤研究提供了实验数据,为进一步探寻压力作用与骨关节炎的关系提供了实验平台。     

绞股蓝总皂甙含量与其营养器官和生长期相关性的研究

应用组织化学和植物化学方法,研究绞股蓝总皂甙含量与其营养器官和生长期的相关性。结果表明,不同营养器官中绞股蓝总皂甙含量叶最高,茎次之,根茎和根最低。绞股蓝地上部分总皂甙含量从营养生长→开花→结果不同生长期呈现由低→高→低的变化趋势,其中7、8、9月的开花期绞股蓝总皂甙含量达到顶峰,为药材最佳采收时间。研究还得出,绞股蓝叶的形态结构特征与其总皂甙含量相关,可作为选育绞股蓝优良品种的指标。     

嗜热毛壳菌CT2纤维二糖水解酶Ⅰ在毕赤酵母中的高效表达

嗜热毛壳菌ChaetomiumthermophilumCT2可产生具有重要工业生产价值的纤维素酶类。RT-PCR扩增cbh1成熟蛋白的编码基因,利用基因重组的方法构建可在毕赤酵母分泌表达系统中表达纤维二糖水解酶的重组表达载体,并转化毕赤酵母得到重组子。在毕赤酵母醇氧化酶AOX1基因启动子的作用下,重组蛋白得到高效表达,小规模发酵量达1.42mg/mL。表达蛋白分泌到培养基中,分子量约80kD;以脱脂棉为底物测得酶活为21U/mL。表达蛋白在60℃稳定,70℃保温60分钟仍保持90%的酶活力,具有较高的热稳定性。