抑制花生四烯酸代谢活性中药研究现状

全面系统地整理了国内外关于通过抑制花生四烯酸代谢活性所进行的抗血栓、抗动脉硬化中药筛选的研究现状,其中包括黄酮、香豆素、生物碱、有机酸、糖等类物质。     

GDNF缺失突变体的设计及其结构与功能关系(英文)

研究了GDNF结构与功能的关系 .基于鼠源GDNF的晶体结构 ,利用计算机SGIIndigo2(R4 4 0 0 )工作站和InsightⅡ (95.5)蛋白质分析软件模拟了人GDNF三维结构 ,设计了GDNF分子的两个缺失突变体ΔN1 2 8和ΔN78 90 .以野生型GDNFcDNA作为模板 ,用PCR法得到编码缺失突变体的DNA片段 .将大肠杆菌作为表达系统 ,使缺失突变体GDNF在大肠杆菌中表达 ,对表达产物纯化和复性后进行生物活性测定 .两株突变体在大肠肝菌中获得了高效表达 ,纯化后的GDNF突变体ΔN1 2 8可以与存在于KG 1a细胞表面的受体结合 ,但不能促进 8日龄鸡胚背根节突起的生长 .突变体ΔN78 90既不能与受体结合 ,同时也失去了促背根节突起生长的功能 .说明GDNF分子的N端氨基酸对分子的生物学活性很重要 ,但对分子与受体GDNFR α的结合并不是必需的 ,而分子中的螺旋区对分子与受体的结合以及生物学活性都必不可少 .     

蓖麻毒素A链突变体的设计,表达与活性研究

利用蛋白质结构同源模建并结合表观静电势分析,设计了拟具有生物学活性的蓖麻毒素Ａ链的突变体。将ＰＣＲ扩增的突变体基因,导入ｐＫＫ２２３－３载体中,于大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中获得高效、可溶性表达,而且,确证了表达产物具有预期的生物学活性。     

抗H5N1病毒嵌合IgA抗体基因的构建及其在CHO细胞中的表达

为了表达具有中和活性的抗禽流感H5N1病毒人-鼠嵌合IgA抗体,采用RT-PCR法克隆具有中和活性的抗禽流感H5N1-HA鼠源单克隆抗体的轻重链可变区基因及相应的信号肽编码序列,分别与人免疫球蛋白IgA2重链恒定区、Kappa恒定区基因拼接,构建表达质粒pEF-IGHA9和pEF-IGK9,共转染二氢叶酸还原酶缺陷型CHO(CHO-dhfr-)细胞,用ELISA检测培养上清中嵌合IgA抗体的表达,对纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE、Western blotting印迹分析。结果成功地在CHO细胞中表达了抗禽流感H5N1病毒人-鼠嵌合IgA抗体,为制备抗H5N1重组分泌型IgA预防性抗体制剂奠定了良好的基础。     

用DREAM技术进行全长质粒快速定点突变

利用“设计限制酶辅助突变”(Designed Restriction Enzyme Assisted Mutagenesis, DREAM)进行全长质粒快速定点突变。根据突变位点附近氨基酸靶序列, 以简并密码子进行逆向推导, 这样在不改变氨基酸序列的前提下可以得到数目巨大的隐性突变体(Silent mutants), 这些突变体中包含大量的限制性酶切位点, 选择合适的酶切位点设计引物, 用Phusion超保真DNA聚合酶扩增全长质粒的DNA序列, 得到的PCR产物用T4多聚核苷酸激酶添加5￠磷酸基团后进行平末端连接, 转化大肠杆菌受体菌后用设计的酶切位点进行快速筛选。本研究用该方法成功地纠正了长约8 kb的质粒pcDNA3.1-pIgR中的突变碱基, 从而获得了多聚免疫球蛋白受体(pIgR)的野生型氨基酸序列。以上结果表明: 利用DREAM技术将限制性酶切位点引入目的基因而不改变目的蛋白质的氨基酸序列, 使突变体的筛选简单化; 配合使用高保真和高效率的Phusion DNA聚合酶可以进行长达8 kb的全长质粒的快速突变; 该方法无需使用定点突变试剂盒和特殊的受体菌, 同时避免了核酸杂交以及同位素的使用。     

核糖体蛋白RPL15 cDNA序列在真骨鱼类系统进化研究中的价值 &

应用RT-PCR, 从真骨总目（Teleostei）5目15种鱼类中首次克隆了核糖体大亚基蛋白L15 (RPL15, ribosomal protein L15) 的完整cDNA序列。以海鲢形亚组（Elopomorpha）的鳗鲡作为外类群, 对这些真骨鱼类的核糖体蛋白L15 cDNA序列进行了系统发育分析, 结果表明: (1)RPL15基因在真骨鱼类等许多真核生物进化中高度保守; (2)系统树中各物种之间的关系与形态分类一致。RPL15编码区适合于真骨鱼类目以上分类阶元的分子系统学研究。      

早期生长反应因子-1的特异脱氧核酶对球囊损伤大鼠颈动脉后转化生长因子-β1表达的影响

目的观察局部转染早期生长反应因子-1(Egr-1)的特异脱氧核酶(ED5)对球囊损伤颈总动脉后内膜增生及转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响,并初步探讨ED5抑制球囊损伤后内膜增生的机制。方法96只健康雄性Wistar大鼠,随机分为4组,每组24只。除假手术组外均应用2F球囊导管行颈总动脉内膜球囊损伤术,术中采用转染试剂FuGENE6介导ED5转染至损伤后大鼠血管中,以假手术组、单纯损伤组,FuGENE6组作为对照。术后3、7、14、21d处死动物每组6只。应用HE染色,RT-PCR,Western-blot和免疫组织化学方法观察大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生情况和TGF-β1的表达及ED5对它们的影响。结果(1)内皮损伤后3d内膜增厚不明显,7d内膜开始增厚,14、21d时内膜明显增厚。(2)TGF-β1mRNA于术后3d开始升高,7d达高峰,14d时下降。TGF-β1蛋白表达于术后3d开始升高,14d达高峰。(3)转染ED5治疗后,在各个时间点内膜增厚程度减轻,TGF-β1表达减少,与对照组比较差异有显著性(P<0·01)。结论血管内皮损伤后内膜增生过程中TGF-β1表达增加,ED5能抑制TGF-β1的表达,从而减轻血管损伤后内膜的增生。     

微波对阿维拉霉素产生菌诱变效应的研究

阿维拉霉素产生菌SV微波诱变效应的研究发现：菌株SV对微波敏感（微波处理60s,SV菌株存活率低于10％）,菌落形态变化大。微波诱变处理最佳作用方式为培养皿不加盖、快速冰上冷却,最佳处理时间为50s（其正突变率25．3％）。通过微波诱变处理、阿维拉霉素推理筛选,最终获得一株稳定性良好,阿维拉霉素产量达到21．5mg／L,较出发菌株提高119．4％的突变株SV-15。     

基孔肯亚假病毒模型的建立及其在模拟检测中的应用

目的:构建含基孔肯亚病毒核酸序列的重组慢病毒载体,以之转染细胞以分泌含基孔肯亚病毒核酸序列的假病毒,利用该病毒建立基孔肯亚病毒的模拟检测方法。方法:人工合成基孔肯亚病毒部分保守性核酸序列,连入慢病毒载体,构建含基孔肯亚病毒核酸序列的重组慢病毒质粒pLenti-chik,该质粒连同辅助质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG共转染293FT细胞;72 h后收集上清,用特异引物进行荧光定量RT-PCR检测。结果:建立了一个仅能进行一次复制、高度安全的基孔肯亚假病毒模型;同时采用荧光定量RT-PCR建立了较灵敏的检测病毒分泌的方法。结论:假病毒可以模拟基孔肯亚病毒分泌,但较真病毒安全性更高;用荧光定量的方法可以很灵敏地检测病毒的分泌,为突发基孔肯亚病毒感染的检测做好准备。