细菌趋化过程中信号转导系统研究

趋化是细菌为了更好的生存而趋利避害的一种运动形式,从感知外界化学物质到最终做出反应,细菌中的信号转导系统起到了接收信号,并将信号传递到鞭毛蛋白进而改变细菌运动形式的功能。到目前为止,细菌趋化过程中的信号转导系统已经得到了详尽的研究。信号的接收、传递,系统中蛋白的定位,结构、转导机制等方面均有研究。本文对细菌趋化过程中信号转导系统的研究现状进行了综述。     

河蚌血细胞对细菌趋化移动的初步研究

采用改进的毛细管法 ,研究了圆背角无齿蚌 (Anodontawoodianapacifica)和三角帆蚌 (Hyriopsiscum ingii)两种淡水河蚌离体血细胞对两种水体中常见病原细菌的趋化移动作用 ,及血清对其的影响。结果显示 ,两种河蚌的离体血细胞对细菌都具有趋化移动作用 ,产生趋化移动的血细胞数量都显著高于无细菌的对照组 (P <0 0 5 )。在有血清时 ,血细胞对荧光极毛杆菌 (Pseudomonasfluorescens)的趋化移动活性略高于肠型点状气单孢菌 (Aeromonaspunctataf.intestinalis) ,圆背角无齿蚌离体血细胞的趋化移动能力显著高于三角帆蚌 (P <0 0 5 )。血清对河蚌离体血细胞的趋化移动作用有显著的促进作用 (P <0 0 5 )。     

AI-2/LuxS群体感应系统介导乳酸杆菌益生特性研究进展

群体感应(quorum sensing,QS)是细菌间通过化学信号分子进行信息传递的一种形式。信号分子可以分为4大类:寡肽(oligopeptides)、酰基高丝氨酸内酯(acyl-homoserine lactone,AHL)、自体诱导物2(autoinduction-2,AI-2)和扩散信号因子(diffusible signal factor,DSF),其中AI-2和其生物合成关键酶LuxS组成的QS系统(AI-2/LuxS系统)介导革兰氏阳性(G+)和阴性(G-)细菌的种内和种间信息交流。乳酸杆菌(Lactobacillus)是一种存在于人体内的益生菌,具有抑制病原微生物、维持肠道微生态平衡和增强机体免疫力等生理功能。综述了AI-2/LuxS QS系统介导Lactobacillus耐酸、抑制病原微生物、对肠表皮细胞的黏附和形成生物膜以及在动物消化道中的存活性等益生特性方面的分子机制。     

食源假单胞菌群体感应信号分子的研究

从市售鲜鱼中分离的3株革兰氏阴性菌,经16S rDNA鉴定为假单胞菌属,该菌是一种导致食品腐败的重要腐败细菌。N-酰基-高丝氨酸内酯(AHLs)是革兰氏阴性菌群体感应(QS)系统中一类重要的信号分子,以密度依赖的方式调控某些生理性状的表达。利用AHLs检测菌株对3株假单胞菌进行检测发现,均产生AHLs类信号分子,且FML05-1和FML05-2至少产生两种AHLs,主要的信号分子是N-3-氧代-辛酰基-高丝氨酸内酯(N- 3-oxo-C_8-HSL)。同时对菌株FML05-2在生长过程中所产生的AHLs的活性变化进行研究,发现AHLs活性在菌体生长至12h时达到最大。首次对食源假单胞菌所产生的AHLs进行了研究,为以干扰腐败细菌群体感应为靶点的食品防腐保鲜策略提供研究基础。     

美国微生物学会会讯摘要

1.近来,对囊泡肺纤维化病(cystic fibrosis)患者的细菌群体研究发现,在生物膜中非致病菌可分泌信号,诱导周围的铜绿假单胞菌(又称绿脓杆菌)的毒力基因,引起肺部阻塞性病变.虽然早已了解生物膜中群体细菌的生物活性与浮游的细菌不同,但要证明这一点有一定技术上的问题.加拿大学者Surette等发展了一种技术将细菌混合接种于磁珠上,磁珠上已有不同组织特异的蛋白,形成生物膜后,可利用磁珠吸引法,将生物膜中的细菌与游离菌分离,转人微量孔培养板分析其特性.这一技术称为Magna Film.通过研究发现,口咽部的正常菌群可以启动绿脓杆菌的毒力基因,包括弹性酶和外毒素基因.诱导毒力基因的过程是由自身诱导素-2(autoinducer-2,AI-2)介导的,虽然绿脓杆菌自身不产生AI-2,但自患者痰中分离的咽正常菌群却可产生不等量的AI-2,因此口咽部正常菌群通过分泌信号可诱导绿脓杆菌的毒力基因.     

一株产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶的氢氧化细菌的分离鉴定及酶活力测定

[目的]以结瘤豆科植物紫花苜蓿根际土壤为研究材料,筛选具有ACC脱氨酶活力的氢氧化细菌,探索氢氧化细菌植物促生作用机制.[方法]利用持续通H2 的气体循环培养体系、矿质盐固体培养基,分离、培养氢氧化细菌,观察菌株形态并测定生理生化特征;16S rDNA序列分析法构建系统发育树;采用薄层层析法筛选ACC脱氨酶阳性菌株,茚三酮显色法测定ACC脱氨酶活力.[结果]分离的37株细菌中有8株菌氧化氢和自养生长能力较强,初步确定为氢氧化细菌,从中筛选出1株ACC脱氨酶阳性菌株WMQ-7.菌株WMQ-7的形态特征、生理生化特征与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的特征基本一致;16s rDNA序列(GenBank登录号为EU807744)在系统发育树中与恶臭假单胞菌同属一个类群,序列同源性99%.鉴定菌株WMQ-7为恶臭假单胞菌,其ACE脱氨酶活力为0.671 U/μg[结论]采用气体循环培养体系分离氢氧化细菌,克服了传统配气法的局限.ACC脱氨酶阳性菌株的筛选,为深入研究氢氧化细菌作为植物根际促生菌的菌株特性和促生机制提供理论依据.     

田菁根瘤菌YIC4027可溶性趋化受体Tlp1的功能鉴定

【目的】初步探究田菁根瘤菌Sinorhizobium alkalisoli YIC4027中唯一含有PAS结构域可溶性趋化受体Tlp1的功能机理。【方法】本研究基于Red重组系统以及三亲接合技术进行缺失突变株的构建。对野生型和突变株的生长情况、趋化能力、趋氧性、细胞凝结、生物膜的形成、胞外多糖产量、在宿主根表的定殖及竞争性结瘤等表型进行了测定。【结果】与野生型相比,突变株的生长不受影响,趋化和趋氧能力降低,在宿主根表的定殖及竞争性结瘤能力降低,而细胞凝结能力、生物膜形成以及胞外多糖产生能力等均有所提高【。结论】本研究首次证实了S. alkalisoli YIC4027中可溶性趋化受体Tlp1影响细胞的趋化运动。     

CTL趋化蛋白在抗病毒中的作用

趋化蛋白是一类与炎症反应密切相关的小分子蛋白南,在机体抗病毒免疫中起重要作用。某些趋化蛋白可正向趋化、吸收病毒持异性ＣＴＬ至病感染局部ＣＴＬ除可直接裂解感染细胞或释放广谱的抗因子以精除病毒感染外,还可分泌多种趋化蛋白,介导各种非特异性炎性细胞,甚至牧场划性ＣＴ本身的迁移、增殖和协同作用在抗病毒感染中发挥协调作用。某些病毒可编码产生趋化蛋白／趋化蛋白受体样分子或拮抗剂,逃避宿主免疫细胞的攻击。     

铜绿假单胞菌群体感应信号分子PQS的功能多样性研究进展

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种革兰氏阴性条件致病菌,可对免疫功能低下或损伤的患者造成持续性感染。铜绿假单胞菌能成功感染离不开其自身产生的毒力因子,而这些毒力因子大多数都受群体感应系统(quorum sensing,QS)调控。铜绿假单胞菌有4个QS系统,分别为las系统、rhl系统、pqs系统和iqs系统。2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮(Pseudomonas quinolone signal,PQS)作为铜绿假单胞菌pqs系统的信号分子,不仅能够调控许多毒力因子的表达,也能够影响一些微生物和宿主的多种生理过程。本文总结了PQS多种生物学功能,如介导QS系统、调控生物被膜形成、介导外膜囊泡产生及铁摄取、调节宿主免疫活性、介导细胞毒性作用,以及提供种群保护等。本文旨在突出铜绿假单胞菌PQS的功能多样性,并为PQS新功能研究和抗菌药物的研发提供指导。     

海洋细菌粪产碱菌J481中DMS趋化受体的鉴定

【目的】β-二甲基巯基丙酸(β-dimethylsufoniopropionate,DMSP)是海洋环境中重要的含硫有机化合物,会被海洋中的微生物裂解并释放出挥发性气体二甲基硫醚(dimethylsulfide,DMS)。该反应的生物学意义尚不明确,前人曾有少量研究表明DMSP可能是趋化效应物。本研究旨在鉴定DMSP趋化作用中的信号分子以及该过程中的趋化受体基因。【方法】挖掘出基因组中含有甲基趋化受体蛋白结构域(methyl-accepting chemotaxis protein,MCP)的全部基因,并预测趋化受体蛋白的结构特征及功能。通过同源重组构建所有趋化受体的缺失突变株,并通过软琼脂平板实验观察趋化表型确定DMS的趋化受体。【结果】对不同化合物DMSP、DMS、丙烯酸进行鉴别后,明确趋化信号分子为DMS。从粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)J481基因组中一共挖掘到8个潜在编码趋化受体蛋白的基因,分别构建对应的缺失突变株,并通过实验筛选出D6I95_17420基因为编码识别DMS的趋化受体蛋白基因。【结论】D6I95_17420基因为编码DMS的趋化受体蛋白的基因,为之后进一步阐明DMS作为信号分子在细胞内的调控作用奠定了基础。     

信号分子AI-2合成关键基因luxS对副溶血性弧菌生物学特性的影响

[背景]副溶血性弧菌是全球范围重要的食源性病原菌,能引起急性肠胃炎。群体感应系统LuxS/AI-2影响细菌的生物学特性,为研究副溶血性弧菌的传播机制和控制技术提供了新的途径。[目的]探讨群体感应信号分子AI-2合成关键基因luxS对海产品中分离的副溶血性弧菌Vp2009027生物学特性的影响。[方法]利用自杀质粒同源重组技术敲除信号分子AI-2合成关键基因luxS,构建副溶血性弧菌Vp2009027的luxS基因缺失株,通过比较野生株与luxS基因缺失株的生长曲线、AI-2活性、运动能力、生物膜形成能力和耐药性,分析LuxS/AI-2系统对副溶血性弧菌生物学特性的影响。[结果]构建了副溶血性弧菌Vp2009027的luxS基因缺失株,野生株和luxS基因缺失株的生长无明显差异,luxS基因的缺失导致AI-2合成受阻、运动能力和生物膜形成能力增强、四环素耐药性降低。[结论]luxS基因对副溶血性弧菌的生物学特性具有重要的调控作用,为进一步研究副溶血性弧菌的传播机制和研发控制技术提供基础。     

Comparative genomic and protein sequence analyses of the chemotaxis system of Azorhizobium caulinodans北大核心CSCD

［Objective］ Azorhizobium caulinodans ORS571 can fix nitrogen not only as a free-living organism and an associative-symbiotic bacterium by colonizing the root surface of non-leguminous plants, but also as a symbiotic bacterium by interacting with leguminous plant Sesbania rostrata.Due to its ability to grow and fix nitrogen under three conditions, A.caulinodans uses sophisticated chemotaxis signal transduction systems to transform environmental cues into corresponding behavioral responses.Chemotaxis appears crucial for the growth of A.caulinodansin complicated environment and the construction of associative relationship with the plant.However, little is known about the chemotactic pathway of A.caulinodans.Thus, our study aimed to compare the chemotaxis-like genes of A.caulinodans with those of well-studied species.［Methods］ NCBI protein BLAST was used for searching sequence similarity with default parameter values against the genomes of A.caulinodans.HMMER3, based on Pfam database, was used for comparative analyses of methyl-accepting chemotaxis protein （MCP）.［Results］ There was a major chemotaxis cluster in A.caulinodans and the CheR methylated MCPs independently of pentapeptide motif.There were 43 MCP homologs containing diverse signal-sensing architectures in A.caulinodans.In addition,cytoplasmic domains of these MCPs were all composed of 38 heptad repeats.［Conclusion］ Despite the extremely high homology presented between the chemotactic system of A.caulinodans and those of well-studied species, A.caulinodans shows its own unique characteristics.The classification of these chemotactic pathways by comparative genomics enables us to better understand how A.caulinodansresponds to changes in environment via exquisite signal transductions in chemotaxis system.     

和厚朴酚对大肠埃希氏菌生物被膜形成的抑制机制

【目的】研究不同浓度的和厚朴酚(honokiol)抑制大肠埃希菌(Escherichia coli)的供试菌株10389生物被膜(biofilm,BF)形成的作用机制。【方法】用氯化三苯基四氮唑比色法(TTC)和四唑盐减低法(XTT)测定honokiol抑制E.coli10389生物被膜形成的药物最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)及其抑制作用与时间的关系;通过qRT-PCR法检测不同浓度的honokiol对E. coli 10389生物被膜形成基因和群体感应系统相关基因表达量的影响;通过生物发光法和qRT-PCR法检测亚-MIC honokiol对E. coli 10389呋喃糖基硼酸二酯(AI-2)及其调控的与生物被膜形成相关的下游基因表达量的影响。【结果】Honokiol能抑制E.coli10389生物被膜的形成,但不同浓度的honokiol抑制E. coli 10389 BF形成的作用机制不同。其中,与对照组相比,MIC的honokiol能使E. coli 10389 BF形成相关基因编码毒素(hha)和细菌酸性调节因子(ari R) mRNA的表达量显著提高,抗毒素...     

Ensifer alkalisoli YIC4027趋化受体基因的比较及相关蛋白序列分析

[目的] 田菁共生根瘤菌Ensifer alkalisoli YIC4027是从宿主植物田菁的根瘤中分离出来的一株新型高效的固氮菌。本研究对E.alkalisoli的趋化受体基因与其他研究透彻的物种进行比较以及相关蛋白分析。[方法] 利用NCBI的BLAST对E.alkalisoli趋化受体基因进行序列相似性搜索。以Pfam数据库为基础,用HMMR3对甲基化趋化受体蛋白（MCP）进行比较分析。[结果] E.alkalisoli有2个趋化基因簇,共有13个MCP,含有不同的信号传感结构。此外,这些MCPs的胞质结构域除了一个是由40个七肽重复序列组成,其余都是由36个七肽重复序列组成。[结论] 尽管E.alkalisoli的趋化受体与已被广泛研究的物种的趋化受体具有较高的相似性,但仍显示出其特性。通过基因的比对以及相关蛋白的分析,我们能够更好地理解E.alkalisoli是如何通过趋化系统来响应外界变化的。     

几株新鞘氨醇杆菌的趋化性及其相关基因组成特点

【目的】选择了几株隶属于新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)的有和没有多环芳烃(PAHs)降解能力的细菌,在基因组水平比较分析它们的趋化通路,并探究其中一些菌株对芳香化合物和三羧酸(TCA)循环中间代谢产物的趋化性。【方法】通过基因组的比较分析,研究了几株新鞘氨醇杆菌的趋化蛋白组成和趋化基因分布,并采用滴定法和游动平板法检测了相关菌对芳香族化合物和TCA循环中间代谢产物的趋化性。【结果】N.pentaromativorans US6-1、N.pentaromativorans F2、Novosphingobium indicum K13、Novosphingobium stygium DSM 12445、Novosphingobium sp.C2AC等5株新鞘氨醇杆菌对芳香族化合物和TCA循环中间代谢物具有不同程度的趋化性;所选的7株已完成基因组测序的新鞘氨醇杆菌N.pentaromativorans F2、N.pentaromativorans US6-1、Novosphingobium sp.PP1Y、Novosphingobium sp.AP12、Novosphingobium sp.Rr 2-17,Novosphingobium sp.B-7和Novosphingobium sp.DSM 19370均含有趋化蛋白MCP、CheW、CheA、CheB、CheR和CheY,且亲缘关系最近的US6-1、F2和PP1Y 3株菌的che基因簇中的基因排列一致,为che W-Y-D-B-R-A-(X);新鞘氨醇杆菌的趋化系统属Fla类型。【结论】几株新鞘氨醇杆菌都具有较为完整的趋化通路,且对多种芳烃及其代谢物的趋化性各不相同,其中菌株US6-1趋化现象最明显。     

发酵乳杆菌CSC-19胞外粗多糖提取物抑制单核细胞增生李斯特菌生物被膜形成能力的研究

【目的】筛选能有效抑制单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)形成生物被膜的乳酸菌,分析其活性成分并进行功能表征。【方法】采用结晶紫染色法筛选抑制LM形成生物被膜的不同乳酸菌提取物;通过酸中和、蛋白酶处理及热处理,推测抑制生物被膜活性物质以胞外多糖(extracellular crude polysaccharide,ECP)为主;乙醇沉淀法提取目标乳酸菌分离株胞外粗多糖,分析其抑制生物被膜形成活性和对LM生长的影响;运用激光共聚焦扫描显微镜(laser confocal scanning microscopy,LCSM)和扫描电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM)观察胞外粗多糖对生物被膜细胞形态和结构的影响。【结果】发酵乳杆菌CSC-19发酵上清液对1516-2LM生物被膜的抑制率为81.7%;经热和蛋白酶处理后,发酵上清抑制生物被膜形成的活性未发生显著变化(P>0.05),表明发酵上清液中抑制生物被膜形成的物质可能为胞外多糖;在不抑制LM生长的条件下所提取的胞外粗多糖抑制生物被膜形成能力具有浓度依赖性。激光共聚焦扫描显微镜和扫描电子显微镜结果显示,胞外粗多糖显著抑制了生物被膜的形成能力,生物被膜三维、有组织的蜂窝状结构被破坏,仅有少量的粘附细胞分散于细胞爬片表面。【结论】发酵乳杆菌CSC-19胞外粗多糖能有效抑制LM生物被膜的形成,有望应用于高效防控该菌污染食品。     

副溶血性弧菌-霍乱弧菌混合生物被膜形成过程研究

【目的】研究副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)和霍乱弧菌(Vibriocholera,VC)混合生物被膜的形成过程。【方法】在4、8、12、24、36、48、60、72 h测定单独条件下VP、VC及其混合后生物被膜的形成情况,通过结晶紫染色法、平板菌落计数法、测定胞外多糖、胞外蛋白,通过荧光原位杂交(FISH)观察混合生物被膜形成。【结果】虽然形成的混合生物被膜量介于VC和VP之间,但混合生物被膜在形成过程中,成熟期后生物被膜量的变化较小,对环境的抗性增强。混合生物被膜中拥有更多的活菌,混合生物被膜形成过程中胞外蛋白和胞外多糖的变化体现出其可能在对抵御不适应环境中起重要作用,通过FISH可观察到不同时期生物被膜的变化过程。【结论】VC与VP共同形成生物被膜的过程中,混合生物被膜总量虽然减少,但混合生物被膜中拥有更多的活菌,这可能引起更大的危害。研究混合生物被膜形成过程中被膜的变化,可为有害生物被膜的控制提供基础。     

茎瘤固氮根瘤菌环二鸟苷酸代谢相关基因的功能鉴定

【目的】考察茎瘤固氮根瘤菌ORS571中c-di-GMP合成酶AZC-2412的编码基因缺失的突变表型,初步探究其功能机理。【方法】本实验构建基于cre-loxp重组酶系统的根瘤菌基因敲除系统,以及采用三亲接合技术构建突变株。测定野生型和突变株的生长速率、趋化能力、胞外多糖产量、生物膜形成等表型。【结果】突变株与野生型生长速率几乎相同。与野生型相比突变株由于细胞内c-di-GMP水平降低,胞外多糖、生物膜产量等均有所下降。【结论】实验表明,环二鸟苷酸合成酶AZC-2412缺失,使得c-di-GMP水平降低,对胞外多糖生成、细菌的运动能力、生物膜的形成、细胞絮凝、与植物的互作等均有调控作用。     

Cloning, heterologous expression, and functional characterization of the nicotinate dehydrogenase gene from Pseudomonas putida KT2440

6-Hydroxynicotinate can be used for the production of drugs, pesticides and intermediate chemicals. Some Pseudomonas species were reported to be able to convert nicotinic acid to 6-hydroxynicotinate by nicotinate dehydrogenase. So far, previous reports on NaDH in Pseudomonas genus were confused and contradictory each other. Recently, Ashraf et al. reported an NaDH gene cloned from Eubacterium barkeri and suggested some deducted NaDH genes from other nine bacteria. But they did not demonstrate the activity of recombinant NaDH and did not mention NaDH gene in Pseudomonas. In this study we cloned the gene of NaDH, ndhSL, from Pseudomonas putida KT2440. NdhSL in P. putida KT2440 is composed of two subunits. The small subunit contains [2Fe2S] iron sulfur domain, while the large subunit contains domains of molybdenum cofactor and cytochrome c. Expression of recombinant ndhSL in P. entomophila L48, which lacks the ability to produce 6-hydroxynicotinate, enabled the resting cell and cell extract of engineering P. entomophila L48 to hydroxylate nicotinate. Gene knockout and recovery studies further confirmed the ndhSL function.