从病人外周血单个核细胞中检测HHV－6：分离培养和基因扩增

收集婴幼儿急疹及淋巴系统增生性疾病患者外周血单个核细胞进行体外培养,从７例婴幼儿急疹及２例淋巴系统增生性疾病患者中分离出一种病毒,此病毒能在ＰＨＡ激活的人脐血单个核细胞中传代生长,产生典型ＣＰＥ：形成气球样巨细胞。电镜下观察,感染细胞中可见直径１８０ｎｍ左右,有包膜,疱疹样病毒颗粒;血清学试验证明分离株与ＨＳＶ－１,２、ＨＣＭＶ、及ＥＢＶ无抗原交叉,而与ＨＨＶ－６ＧＳ株间存在抗原一致性;多聚酶链反应表明该分离株ＨＨＶ－６特异性ＤＮＡ阳性;综合以上结果,初步认为该分离株为ＨＨＶ－６。同时还用ｐＣＲ法对所收集的标本直接检测ＨＨＶ－６特异性ＤＮＡ。ＰＣＲ法与病毒分离法相比较,前者ＨＨＶ－６检出率为８８．８％（１６／１８）．后者为３８．９％（７／１８）。     

编码人疱疹病毒－6型核糖核苷酸还原酶和P41蛋白基因的克隆和序列测定

本文报道人疱疹病豢－６型（ＨＨＶ－６）ｐＳＴＹ２８ＤＮＡ片段的序列测定。应用分子克隆、缺损突变体（Ｄｃｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔ）制备和序列测定等技术,完成了３．９ｋｂＨＨＶ－６ｐＳＴＹ２８ＤＮＡ片段的全序列测定。经ＤＮＡＳＩＳ核酸蛋白软件分析,该片段含有两个开读框架（ＯＲＦ）核糖核苷酸还原酶（ＲＩＲ）ＯＲＦ有２４１４个核苷酸,可编码８０５个氨基酸;Ｐ４１蛋白由１１００个核苷酸组成。与其他疱疹病毒作氨基酸同源性比较,ＨＨＶ－６ＲｉＲ与人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）有高度同源性,最适记分（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄｓｃｏｒｅ）达４５９。实验结果支持Ｅｓｆｔａｔｈｉｏｕ提出的论点,ＨＨＶ－６属于β－疱疹病毒。     

RT—nested PCR检测肾综合征出血热患者血清病毒核酸

采用异硫氰酸胍－酚－氯仿（ＡＧＰＣ）一步法提取病毒ＲＮＡ,并依据肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）核蛋白（ＮＰ）编码基因保守区核苷酸序列合成两对巢式引物,建立了逆转录巢式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）检测ＨＦＲＳＶＲＮＡ方法,应用此法对ＨＦＲＳＶ感染的ＶｅｒｏＥ６细胞培养液及ＨＦＲＳ患者血清中的病毒ＲＮＡ进行检测。结果显示,感染细胞培养液及３５例ＨＦＲＳ患者血清均为阳性,正常的ＶｅｒｏＥ６     

人类疱疹病毒7型体外生长特点的研究

研究了人类疱疹病毒７型（ＨＨＶ－７）南京株ＹＹ５在脐血单个核细胞（ＣＢＭＣｓ）及ＳＵＰＴ１细胞株上生长特点。观察病毒感染细胞后不同时间病变效应程度,记数死亡细胞百分率,间接免疫荧光染色记数抗原表达阳性细胞数,并用透射电镜观察病毒感染细胞超微结构变化及病毒复制不同时期的特点。结果发现：ＨＨＶ－７在ＣＢＭＣｓ及ＳＵＰＴ１上出现ＣＰＥ时间迟于ＨＨＶ－６,且ＣＰＥ程度也低于ＨＨＶ－６;ＨＨＶ－７在ＳＵＰＴ     

人类疱疹病毒6型的分子生物学研究进展

人类疱疹病毒６型（ＨＨＶ－６）是近几年分离到的、对Ｔ淋巴细胞具有高度亲嗜性的双链ＤＮＡ病毒。ＨＨＶ－６现已分为Ａ、Ｂ两型,它们在生长特性、与单克隆抗体的反应性及限制性酶切图谱等方面存在差异。研究表明ＨＨＶ－６与人类多种疾病有关。随着器官移植的发展和ＡＩＤＳ病人的增多,ＨＨＶ－６的感染变得日益重要。本文主要对其分离培养、流行病学、遗传及分子生物学特性作一综述。     

新型人类疱疹病毒研究进展

人类疱疹病毒－６型（ＨＨＶ－６）和７型（ＨＨＶ－７）是近年来新分离到的对Ｔ淋巴细胞具有高亲嗜性的ＤＮＡ病毒。研究表明,临床上ＨＨＶ－６与多种疾病有关,因而颇受重视。本文对其形态结构及生长特性,血清流行病学,分子生物学,与一些疾病的关系等作简要综述,并略述了ＨＨＶ－７的研究进展。     

人疱疹病毒6型在艾滋病发病中的作用

许多临床和实验研究结果表明人疱疹病毒６型（ＨＨＶ－６）在人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）自然感染过程中起着促进因子的作用。ＨＨＶ－６与ＨＩＶ有着共同的Ｔ细胞嗜性,除此以外,ＨＨＶ－６还能感染杀伤ＣＤ８＾＋Ｔ细胞,ＮＫ细胞单核－巨噬细胞,故认为免疫系统潜在影响更大。弄清ＨＨＶ－６在ＨＩＶ感染过程中对免疫系统的损伤作用,将有助于阐明艾滋病发病的复杂机制。     

猪圆环病毒2型ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

根据ＧｅｎＢａｎｋ中猪圆环病毒２型（ＰＣＶ－２）ＯＲＦ２基因序列,设计一　对引物,应用ＰＣＲ从疑患断奶仔猪多系统消耗综合症（ＰＭＷＳ）的死亡仔猪组织病料中扩增出ＯＲＦ　２全基因（７０２ｂｐ）。将此片段克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ　ｅａｓｙ载体,筛选获得重组质粒ｐＴＯＲＦ２,并对此质　粒中的插入序列进行了测序分析,结果表明本试验克隆的ＯＲＦ２与美国ＰＣＶ－２分离株ＡＦ２６４０３９　的核苷酸及氨基酸序列同源性均达到１００％,与其他ＰＣＶ－２毒株同源性分别为９２．３％～９８．　６％和　９２．３％～９６．６％。重组质粒ｐＴＯＲＦ２经　Ｂａｍ　Ｈ　Ｉ、Ｅｃｏ　Ｒ　Ｖ双酶切,回收ＯＲＦ２基因,转　移入真　核表达载体ｐＳｅｃＴａｇ２／ＨｙｇｒｏＢ的相应酶切位点之间,构建成重组质粒ｐＳｅｃＴａｇＯＲＦ２。此重组表　达载体的构建成功为进一步研究ＯＲＦ２编码蛋白的生物学活性及建立ＰＣＶ诊断试剂盒打下基础。     

球形幽门螺杆菌分子生物学研究

为研究幽门螺杆菌（ＨＰ）球形变异本质,作者通过延期培养和采用亚抑菌浓度抗生素,使３株ＨＰ发生球形变异,对弯曲形和球形ＨＰ作了ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹及４个毒力基因片段ＰＣＲ和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱显示球形ＨＰ分子量在７４×１０４以上的蛋白含量减少,免疫印迹显示球形ＨＰ１２５×１０４蛋白条带反应减弱,而抗生素诱变的球形ＨＰ分子量为１１×１０４和６３×１０４的蛋白条带反应增强。ＰＣＲ及ＰＣＲ－ＳＳＣＰ结果表明球形ＨＰ的ｈｐａＡ,ＶａｃＡ,ＣａｇＡ和ＵｒｅＡ４个毒力基因片段未发生缺失,但在ｈｐａＡ或ＶａｃＡ基因中存在点突变     

水稻草矮病毒血清学和分子检测方法的比较

将间接ＥＬＩＳＡ、非放射性分子杂交和ＲＴ－ＰＣＲ三种方法应用于水稻草矮病毒（ＲＧＳＶ）的检测。结果表明,利用自制的融合蛋白ＧＳＴ－ＮＣ的抗血清检测ＲＧＳＶ的灵敏度为１ｍｇ鲜重的病株叶片或８４ｎｇ提纯病毒,利用地高辛（ＤＩＧ）标记的ＤＮＡ探针ＮＣ的点杂交方法检测ＲＧＳＶ的灵敏度为５０μｇ病叶或６ｎｇ病毒,而ＲＴ－ＰＣＲ的检测灵敏度则为１０μｇ病叶或２ｎｇ的病毒,对上述三种方法的灵敏度和可操作性也进行     

人类疱疹疾病6型的分子生物学研究进展

对人类疱疹病毒６型（ＨＨＶ－６）的分子生物学性质及特点的研究,有利于人们在分子水平上加强对这种病毒的防治和对其科研价值的认识,本文综述了近几年来国外对ＨＨＶ－６基因组结构,病毒ＤＮＡ复制、转录及反式激活作用及病毒蛋白等方面的研究进展。     

逆转录——聚合酶链反应技术诊断丙型肝炎病毒感染

本文采用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术对２１２例住院及门诊病人其中肝病患者９８例（慢性肝炎４３例、肝炎后肝硬化４７例、原发性肝细胞癌８例）进行ＨＣＶ－ＲＮＡ检测。结果９８例慢性肝病患者血清中ＨＣＶ－ＲＮＡ－ＰＣＲ阳性２７例（２７．６％）,１１４例非肝病患者血清中ＨＣＶ－ＲＮＡ－ＰＣＲ阳性９例（７．９％）,两组间差异非常显著（Ｐ〈０．０１）,各种肝病患者的ＨＣＶ－ＲＮＡ－ＰＣＲ阳性率均高于     

HCV5＇端非编码区cDNA的体外转录

采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从广东省一例慢性丙型肝炎病人血清中获得丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５＇端非编码区（５＇ＮＣＲ）３０２ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,经补齐和提纯后插入ｐＵＣ１９质粒,获得的重组体ｐＵＮ进行序列测定。将ｐＵＮ的目的基因亚克隆进体外转录载体ｐＳＰＯＲＴＩ多克隆位点的ＥｏｏＲＩ和ＰｓｔＩ切点之间,所得重组体ｐＳＮ线性化后由Ｔ＿７ＲＮＡ多聚酶及ＳＰ６ＲＮＡ多聚酶引导体外转录反应,产物经凝胶电泳及特异引物ＲＴ－ＰＣＲ,证实ＳＰ６引导的是正义ＲＮＡ,Ｔ７合成的是反义ＲＮＡ,其大小分别力４２９ｂｐ和３６２ｂｐ。并证实所得ＲＮＡ力ＨＣＶ５＇ＮＣＲｃＤＮＡ转录而来。获得的ＨＣＶ５＇ＮＣＲｃＤＮＡ和ＲＮＡ在常规逆转录和ＰＣＲ步骤中用于设立有效的模板对照,对消除假用性及评估试剂有重要意义。同时,ＨＣＶ５＇ＮＣＲ体外转录载体的构建可用于制各ＲＮＡ探针和反义ＲＮＡ,改进后还可作为定量ＰＣＲ的竞争性模板。     

人类疱疹病毒7型的研究进展

人类疱疹病毒７型（ＨＨＶ－７）是继ＨＨＶ－６之后发现的又一亲淋巴细胞的β－疱疹病毒,本文主要对其分子生物学,流行病学,免疫学及致病性等方面近３年的研究进展作一综述。     

肾综合征出血热病毒基因检测及分型的研究

根据流行于我国的两型ＨＦＲＳＶ代表株汉滩型７６１１８株及汉城型Ｒ２２株Ｍ节段的核酸序列,设计两型共同引物,建立了逆转录－聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）方法,检测３９株从不同地区、不同宿主分离的ＨＦＲＳＶ感染鼠脑及细胞培养物;同时还建立了捕捉ＥＬＩＳＡ法（ｃＥＬＩＳＡ）,检测了３９株中的３６株,每份样本设复孔,以Ｐ／Ｎ≥２．１０且Ｐ－Ｎ≥０．１０者判为阳性。ＲＴＰＣＲ及ｃＥＬＩＳＡ两法的检出率分别为９７．６％与８２．４％,二者符合率８４．６％。此外,对ＲＴＰＣＲ产物进行酶切分型,３８份扩增产物中的１５份可被ＡｌｕＩ切开。根据所获酶切图谱的差异,可分为汉滩型及汉城型两型,显示了酶切分型的潜在价值     

逆转录-聚合酶链反应技术诊断丙型肝炎病毒感染

本文采用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ-ＰＣＲ）技术对２１２例住院及门诊病人其中肝病患者９８例（慢性肝炎４３例、肝炎后肝硬化４７例、原发性肝细胞癌８例）进行ＨＣＶ－ＲＮＡ检测。结果９８例慢性肝病患者血清中ＨＣＶ-ＲＮＡ-ＰＣＲ阳性２７例（２７．６％）,１１４例非肝病患者血清中ＨＣＶ-ＲＮＡ-ＰＣＲ阳性９例（７．９％）,两组间差异非常显著（Ｐ（０．０１）,各种肝病患者的ＨＣＶ-ＲＮＡ-ＰＣＲ阳性率均高于非肝病组。６８例患者同时进行了ＨＣＶ-ＲＮＡ-ＰＣＲ检测和抗－ＨＣＶ检测,２５例抗－ＨＣＶ阳性的患者中ＨＣＶ－ＲＮＡ-ＰＣＲ,２１例阳性（８４％）,４３例抗－ＨＣＶ阴性的患者中ＨＣＶ-ＲＮＡ-ＰＣＲ,９例阳性（２０．１％）、有输血及血制品史者４８例,其中ＨＣＶ-ＲＮＡ-ＰＣＲ阳性１６例（３３．３％）,１６４倒无输血史者中ＨＣＶ-ＲＮＡ-ＰＣＲ阳性２０例（１２．２％）,两组间差异非常显著（Ｐ（０．０１）。结果表明：１．ＨＣＶ感染与慢性肝病有密切联系,说明ＨＣＶ感染是慢性肝炎、肝硬化、肝癌的致病因素;２．ＨＣＶ-ＰＣＲ法具有特异性好、灵敏度高、简便快速等特点,弥补了抗－ＨＣＶ检测的不足之处,是目前确定ＨＣＶ感染的主要手段;３．ＨＣＶ感染与输血关系密切,因此对献血员进行常规ＨＣＶ检测对预防由输血所致ＨＣＶ感染有着极其重要的临床意义。     

抗原捕获聚合酶链式反应（AC—PCR）直接分型检测单纯疱疹病毒

用抗单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）型共同性ｇＣ和ｇＤ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）,包被Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管,捕捉ＨＳＶ,同时加入３个引物：一个是ＨＳＶ－１／ＨＳＶ－型共同性上游引物,另两个分别是ＨＳＶ－１和ＨＳＶ－２型特异性下游引物。借此建立了能直接分型检测ＨＳＶ的抗原捕获聚合酶链式反应（ＡＣ－ＰＣＲ）。ＨＳＶ－１的扩增产物为４７７ｂｐ,ＨＳＶ－２的为３９９ｂｐ,两型病毒经ＡＣ－ＰＣＲ扩增后产生分子量不同的ＤＮ     

应用套式PCR对恶性卡他热病毒在不同动物体内变异的研究

应用本实验建立的三组套式ＰＣＲ（ＰＣＲ１、２、３）和一组以前报道的套式ＰＣＲ（ＰＣＲ４）,对５９份外周血淋巴细胞（ＰＢＬ）ＤＮＡ样品进行了恶性卡他热病毒（Ｍａｌｉｇｎａｎｔｃａｔａｒｒｈａｌｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ,ＭＣＦＶ）核酸序列的检测。这些样品来自５１只羊,以及与羊接触而发病的６头牛和２只鹿。除ＰＣＲ４外,其它三组ＰＣＲ都能扩增现有４个角马型ＭＣＦＶ分离株。有６只羊在４组ＰＣＲ中都呈阴性,其余５３份样品经ＰＣＲ４检测均呈阳性。ＰＣＲ１只能从４５只羊体检出ＭＣＦＶＤＮＡ,未能从牛和鹿体检出病毒ＤＮＡ。ＰＣＲ２检测的所有样品均呈阴性。在ＰＣＲ３扩增中,除２头牛外,其它５１份样品均呈阳性。通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和限制性酶切分析,对ＰＣＲ１－４产物的特异性进行了鉴定。此外,敏感性实验表明,四组ＰＣＲ的差异也不明显。因此,本实验结果说明ＭＣＦＶ基因组在不同种动物之间发生了变异,羊体内的变异株可能是导致其它反刍动物发病的病原     

HCV/HBV复合抗原基因的克隆、表达及免疫应答研究

为探讨ＨＣＶ／ＨＢＶ 复合疫苗的可行性,将合成的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）复合多表位抗原基因ＰＣＸ与ＨＢｓＡｇ 基因连接成ＰＣＸＳ基因,与β－半乳糖苷酶（ＧＺ）基因融合后在大肠杆菌及减毒鼠伤寒沙门氏菌中获得表达．目的蛋白ＧＺ－ＰＣＸＳ可被抗－ＨＢｓ 及抗－ＨＣＶ 抗体所特异识别．ＧＺ－ＰＣＸＳ抗原皮下注射免疫ＩＣＲ小鼠后,诱发了较高水平的抗－ＧＺ－ＰＣＸＳＩｇＧ反应．构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌ＳＬ３２６１（ｐＷＲ／ＰＣＸＳ）口服免疫小鼠后,诱发了高水平的ＣＤ８＋ Ｔ细胞增殖反应及抗ＧＺ－ＰＣＸＳＩｇＧ反应．所有免疫小鼠均未见明显的毒副作用．该研究揭示,ＨＣＶ／ＨＢＶ 复合抗原可诱发特异性体液免疫及细胞免疫应答,而活菌苗口服可能是理想的免疫途径,为ＨＣＶ／ＨＢＶ 双价疫苗研究提供了一定的理论及实验依据．     

湖北省不同地区汉坦病毒M片段的分析研究

参考汉坦病毒（ＨＶ）的基因文库软件设计Ｍ片段Ｇ－１区型特异性引物,以ＨＶ　７６／１１８、Ｈ－１１４、Ａ－９及Ｒ－｛２２｝株ＲＮＡ为阳性模板,建立ＨＶ的分型方法──逆转录一半巢式聚合酶链反应（ＲＴ－ｈｅｍｉｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ）,对湖北省不同地区分离的３０株ＨＶ进行分　型。结果显示：（１）建立的ＲＴ－ｈｅｍｉｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ分型方法对ＨＶ两型的代表株７６／１１８（ＨＴＮ）、Ａ－９（ＨＴＮ）、Ｈ－１１４（ＨＴＮ）及Ｒ－｛２２｝（ＳＥＯ）ＲＮＡ进行了特异性扩增,其大小与理论值一致;此　法只能检测ＨＶ　ＲＮＡ,不能检测其它病毒ＲＮＡ。（２）分离于湖北省不同地区的３０株ＨＶ的分型结果　为汉滩型２１株、汉城型９株,其中长江以南汉滩型１２株、汉城型２株;长江以北汉滩型９株、　汉城型７株。这表明建立的ＲＴ－ｈｅｍｉｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ用于ＨＶ的检测特异性好;分析湖北省不同　地区分离的３０株ＨＶ,显示湖北省ＨＦＲＳ流行为混合疫区;且在湖北地区具有一定的地理聚集性。