SAHA对TGF-β诱导人胚肺成纤维细胞α-SMA蛋白及前胶原蛋白mRNA表达的影响

目的:探讨在转化生长因子-β 1(TGF-β1)刺激下,组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)对人胚肺成纤维细胞系HELF向肌成纤维细胞(MF)分化时,α-SMA蛋白及前胶原蛋白mRNA表达的影响.方法:体外培养人胚肺成纤维细胞系HELF,并根据不同的实验目的分为空白对照组,TGF-β1处理组以及SAHA干预组.细胞处理结束后,用Western blot检测α-SMA表达,RT-PCR检测Ⅰ、Ⅲ型前胶原的mRNA表达水平.结果:空白对照组中几乎无α-SMA蛋白表达,TGF-β1处理后α-SMA水平显著增高,而SAHA能有效降低α-SMA的水平.SAHA孵育24h后,能够明显抑制TGF-βl刺激后的细胞表达Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白mRNA,并且具有明显的剂量依赖性.结论:SAHA能降低TGF-βl诱导HELF细胞向MF转化时α-SMA表达以及前胶原蛋白表达.     

血清bFGF、TGF-β、VEGF的高表达有助于大鼠脑外伤合并肢体骨折的快速愈合

为揭示脑外伤对血清b FGF、TGF-β、VEGF表达和肢体骨折愈合速度的影响机制,本研究选择SD大鼠作为研究对象,分别建立中等程度脑外伤模型和股骨骨折模型,将大鼠分为A组(正常对照)、B组(单纯股骨骨折)、C组(单纯脑外伤)和D组(脑外伤合并股骨骨折),每组25只,分别检测手术前0 d及手术后3 d、7 d、15 d和30 d时的血清bFGF、TGF-β和VEGF水平,并考察不同时间点骨折愈合情况。结果发现,B组在术后3 d时bFGF、TGF-β和VEGF水平迅速达到高峰,此后逐渐降低。而C组和D组的三种细胞因子水平变化趋势类似,均在术后15 d时达到最高。组间比较显示,D组大鼠在术后3～30 d期间内bFGF水平显著高于C组,并且在7 d、15 d和30 d时bFGF水平高于B组。D组在7 d、15 d和30 d时的TGF-β水平显著高于B组和C组。D组在15 d和30 d时的VEGF水平显著高于B组和C组。并且,D组3种生长因子在整个实验期间的最高值均显著高于其他组。HE染色结果显示,脑外伤合并骨折的大鼠其肉芽组织、成纤维细胞、骨小梁、板层骨形成速率均显著高于单纯骨折大鼠,而X线显示该组骨痂量和密度明显高于单纯骨折组。本研究的结果说明,脑外伤合并股骨骨折大鼠的b FGF、TGF-β和VEGF水平显著高于单纯脑外伤或股骨骨折大鼠,并且其骨折愈合速度也更快。bFGF、TGF-β和VEGF水平均可在脑外伤和骨折大鼠血清中高度表达,而脑外伤的发生可能通过改变bFGF、TGF-β和VEGF等生长因子水平,从而间接促进大鼠自身的骨折愈合,本研究的成果可作为临床骨科治疗研究的借鉴与参考。     

全蝎软膏联用积雪苷软膏治疗增生性瘢痕的效果评价

目的:观察全蝎软膏联用积雪苷软膏在早期治疗增生性瘢痕的治疗效果,并进一步探对组织中TGF-β信号通路的影响。方法:选取新西兰大白兔建立兔耳增生性瘢痕模型,随机平均分为对照组、模型组、全蝎软膏组、积雪苷软膏组和联合用药组;术后立即在治疗组患处涂抹全蝎软膏和/或积雪苷软膏,空白组和模型组涂抹PBS处理,连续用药35天并拍照记录各组瘢痕的治疗情况;于术后35 d收集各组兔耳组织样本进行病理检测、荧光定量PCR和western blot检测。结果:模型组于术后35天可见明显增生性瘢痕,各治疗组中联合用药组比单独药物治疗组的抑制效果更为显著,经治疗后无增生性瘢痕出现。H.E染色结果显示,与模型组相比,各治疗组经治疗后组织纤维化程度均减轻,胶原蛋白量均有不同程度降低,但联合用药可显著改善组织纤维化程度。荧光定量PCR和western blot检测结果表明,与模型组相比,治疗组组织内的MMP水平均呈上升趋势,Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(Col Ⅲ)及Samd 4蛋白水平均不同程度下降,联合用药组差异最为显著,治疗效果优于单独用药组。结论:全蝎软膏联用积雪苷软膏可有效改善组织内细胞纤维化水平并减少胶原蛋白的沉积,可通过Smad 4蛋白的表达量调控TGF-β信号通路而抑制增生性瘢痕的形成。     

鞘鞍醇激酶-1抑制剂PF-543改善1型糖尿病心肌纤维化的实验研究

目的:研究鞘鞍醇激酶-1抑制剂PF-543对1型糖尿病心肌纤维化的影响及其机制。方法:取60只8周龄雄性C57BL6J小鼠,随机分为对照组、对照+PF-543组、1型糖尿病组及1型糖尿病+PF-543组。采用禁食后一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ,150 mg/kg)构建1型糖尿病模型。造模后每天通过腹腔注射给予溶媒或PF-543(1 mg/kg),持续至造模后第16周末。造模第16周末采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测心肌组织1-磷酸鞘鞍醇(S1P)浓度;采用心脏超声评估心脏收缩与舒张功能;Masson三色法染色以评估心肌纤维化情况;Western blot检测心脏转化生长因子-β1(TGF-β1)、I型胶原蛋白(Col I)、Ⅲ型胶原蛋白(Col Ⅲ)表达水平。结果:1型糖尿病+PF-543组小鼠血浆及心肌S1P水平显著低于1型糖尿病组(所有P0.05)。超声结果显示,1型糖尿病+PF-543组小鼠心脏左心室射血分数(LVEF)显著高于1型糖尿病组(65.7±3.3%vs 54.4±3.4%,P0.05),左心室舒张末期内径(LVEDD)显著小于1型糖尿病组(3.81±0.21mm vs 4.52±0.20mm,P0.05)。Masson三色法染色显示1型糖尿病+PF-543组心肌纤维化程度显著低于1型糖尿病组(7.13±0.32%vs 10.21±0.41%,P0.05)。1型糖尿病+PF-543组小鼠心脏TGF-β1、Col I与Col Ⅲ蛋白表达水平均低于1型糖尿病组(所有P0.05)。结论:鞘鞍醇激酶-1抑制剂PF-543可显著降低1型糖尿病小鼠血浆与心脏S1P水平,降低心脏TGF-β1表达与胶原蛋白沉积,改善1型糖尿病小鼠心脏纤维化与心功能。     

瑞舒伐他汀对压力超负荷型心肌肥厚大鼠TGF-β1表达的影响

目的:观察瑞舒伐他汀对大鼠压力超负荷型心肌肥厚的作用,并探讨其对TGF-β1表达的影响.方法:将SD大鼠随机分为5组.除假手术组外各组通过不完全结扎大鼠腹主动脉构建心肌肥厚模型,A为假手术组,B为单纯手术组,C为卡托普利组(50mg/kgod),D组为瑞舒伐他汀小剂量组(2 mg/kgod),E为瑞舒伐他汀大剂量组(4 mg/kgod),各组动物术前一周始灌胃给予相应药物直至术后4周,A、B纽给予等量生理盐水.给药第5周末,测定各组大鼠血压和心脏质量指教;采用RT-PCR法和免疫组化法检测左室心肌组织中TGF-β1mRNA和TGF-β1蛋白表达.结果:术后4周各组动物血压和HMI较A组明显增加(P<0.01或P<0.05),而C、D、E组较B组有显著下降(P<0.01或P<0.05);同时各治疗组左室心肌组织中TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白表达较B组有显著下降(P<0.01),且C组抑制表达较D、E组更为显著(P<0.05或P<0.01).结论:瑞舒伐他汀可有效的缓解压力超负荷诱导的大鼠心肌肥厚,且作用类似卡托普利,其可能通过降低左室心肌TGF-β1表达,影响TGF-β信号转导产生作用.     

TGF-β3与TIMP-2联合转染兔骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白/壳聚糖生物支架修复兔软骨缺损(英文)

目的:TGF-β3广泛存在于骨组织、软骨组织中,能诱导体外培养的间充质干细胞向软骨分化、生长。TIMP-2能抑制MMP对软骨基质的降解,保护新生软骨组织。本实验探讨单纯TGF-β3和TGF-β3,TIMP-2联合转染兔骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白壳聚糖/(silk fibrin/chitosan,SF/CS)生物支架植入动物体内修复兔膝关节软骨缺损的可行性及效果差异。方法:将新西兰大白兔20只分为4组,每组5只(支架组、未转染组、reAAV-TGF-β3转染组、reAAV-TGF-β3,reAAV-TIMP-2联合转染组)。在无菌条件下取兔第三代对数生长期骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),用携带目的基因的重组腺相关病毒进行转染,将转染成功的BMSCs与SF-CS生物支架复合,分别植入兔膝关节软骨缺损处:未转染组植入SF-CS生物支架,未转染组植入未转染的BMSCs复合SF-CS生物支架,reAAV-TGF-β3转染组植入reAAV-TGF-β3转染的BMSCs复合SF-CS生物支架,reAAV-TGF-β3,TIMP-2联合转染组植入reAAV-TGF-β3,TIMP-2联合转染的BMSCs复合SF-CS生物支架。两月后处死家兔,肉眼观察以及HE染色评定缺损软骨修复情况。并进行软骨细胞特征性染色即甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组化染色鉴定。结果:两个月后除支架组外各实验组兔膝关节软骨缺损处均有软骨样物质形成,且联合转染组诱导的新生成分更接近缺损处周围正常软骨。联合转染组与reAAV-TGF-β3转染组;联合转染组与未转染组;reAAV-TGF-β3转染组与未转染组的评分差异均具有统计学意义(P0.05)。HE染色结果提示联合转染组软骨修复效果较单纯TGF-β3转染组更好。结论:单纯TGF-β3转染兔骨髓间充质干细胞对兔膝关节软骨缺损有修复作用,TGF-β3与TIMP-2联合转染组修复缺损效果更明显,提示TIMP-2与TGF-β3具有协同效应。     

Smad2/3上调促进大鼠梗阻性肾病的纤维化和凋亡

目的观察TGF-β1/Smads信号传导途径对大鼠肾间质纤维化表达的影响.方法 40只Wistar大鼠分为假手术组及模型组.单侧输尿管结扎术式(UUO)建立肾梗阻模型.分别于术后3、6、14和28d处死动物.应用免疫组织化学和流式细胞学技术来检测TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3和观察细胞外基质以及细胞凋亡的改变.MASSON染色观察肾间质病变程度.结果与假手术组相比,模型组于术后3d梗阻肾TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3开始升高,细胞凋亡百分率同时升高,I型胶原及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平亦升高.第6d各项指标水平显著升高.第14、28d升高更加明显(P＜0.01).B3、B6、B14和B28组之间也随天数增加而显著升高(P＜0.01).肾间质病变面积增加显著(P＜0.01).结论在肾间质纤维化中TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3及细胞凋亡明显上升,同时I型胶原及α-SMA表达升高及肾间质纤维化程度增加.TGF-β1/Smads信号传导途径在肾间质纤维化形成中可能起着重要促细胞外基质沉积和细胞凋亡的作用.     

葛根素对腹膜透析液诱导人腹膜间皮细胞分泌TGF-β1的影响

目的:了解葛根素对腹膜透析液干预下的体外培养人腹膜间皮细胞分泌转化生长因子β1(TGF-β1)的影响.方法:体外培养的人腹膜间皮细胞,分对照组、PDS组、A组(葛根素终浓度为50μg/mL)、B组(葛根素终浓度为100μg/mL)、C组(葛根素终浓度为200μg/mL)五组观察.检测各组上清液中TGF-β1的含量并比较.结果:腹膜间皮细胞在PDS干预下,TGF-β1分泌显著增加,添加葛根素再干预的A、B、C组TGF-β1分泌与PDS组比较有显著下降.结论:葛根素对腹膜透析液诱导的腹膜间皮细胞分泌致纤维化因子TGF-β1具有抑制作用.     

TGF-β1通过激活Smad信号途径抑制PI3K/AKT信号介导的BMSC成脂分化

转化生长因子β1 (TGF-β1) 是参与骨髓间充质干细胞（BMSCs）脂肪定向分化的重要调节因子,其具体的调节机制尚不清楚. 本研究证明,BMSCs在体外分化为脂肪细胞的过程中, TGF-β1的基因表达显著下调,重组TGF-β1能够抑制BMSCs体外脂肪细胞定向分化,其分化的标志蛋白C/EBPβ和αP2的表达水平显著降低. TGF-β1在激活Smad信号通路的同时,还抑制胰岛素(脂肪分化的主要诱导剂)对PI3K/Akt信号通路的激活.加入Smad特异性阻断剂后,C/EBPβ和αP2的诱导表达恢复正常,同时PI3K/Akt信号通路的活化亦得以恢复. 结果提示,TGF-β1可通过Smad信号通路干扰脂肪细胞分化的核心信号通路-PI3K/Akt的活化,从而实现对BMSCs脂肪分化的抑制.该研究结果为肥胖等导致的心血管疾病或Ⅱ型糖尿病等的临床治疗提供有价值的参考.     

TGF-β2在低氧条件下诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化 的研究

目的：探讨转化生长因子β2(TGF-β2)在低氧条件下诱导骨髓基质干细胞(BMSCs)向软骨细胞分化的作用。方法：无菌条件下 分离Wistar 大鼠股骨骨髓,采用全贴壁培养法纯化BMSCs。传6 代后,将细胞随机分为3 组,A组加入25 ng/mL TGF-β2在1%氧 浓度条件下培养;B 组加入25 ng/mL TGF-β2在21%氧浓度条件下培养;C 组仅加入含10%胎牛血清的DMEM-α培养液在1%氧 浓度条件下培养。3 周后,通过甲苯胺蓝染色检测细胞糖胺多糖,聚合酶链反应检测Ⅱ型胶原和蛋白聚糖(Aggrecan)的表达水平。 结果：骨髓细胞经换液后贴壁聚集生长,形态均一,连续传代后形态无明显改变。分组培养第1 周,A、C 组生长速度低于B 组;第 2 周各组均出现不规则形态细胞,A、C 组细胞形态小于B 组;第3 周各组均可见透明样基质,以A组最明显。3 周后行甲苯胺蓝 染色,A 组细胞内外均可见丰富的蓝染颗粒,B、C 组染色较A 组略浅。A 组Ⅱ型胶原的表达相对量(1.246± 0.287) 高于B 组 (0.973± 0.365)、C组(0.802± 0.196),差异有统计学意义(P＜0.05);B、C 组比较无明显差异(P＞0.05)。A 组Aggrecan 的表达相对量 (0.833± 0.375)高于B组(0.724± 0.173)、C 组(0.602± 0.091),差异有统计学意义(P＜0.05);B、C 组比较无明显差异(P＞0.05)。结 论：TGF-β2联合低氧环境可明显促进骨髓基质干细胞分化为软骨细胞。     

TGF-β1/Smad 2/3信号通路在椎间盘退变中的作用

临床实践表明,富含血小板的血浆(PRP)注射是延缓椎间盘退变的有效方法,但其作用机制尚不清楚。已有研究表明,活化的血小板可释放转化生长因子-β1 (TGF-β1),它可以正向调节髓核细胞的细胞外基质。本研究旨在揭示TGF-β1/Smad 2/3信号通路在PRP缓解椎间盘退变过程中的作用机制。本研究通过制备新西兰白兔PRP,并使用PRP和TGF-β1抑制剂(SB431542)处理白兔髓核细胞,检测PRP对髓核细胞增殖、软骨形成标志物(CollagenⅡ和Aggrecan) m RNA的表达、Smad 2/3及相关髓核细胞功能蛋白表达的影响。结果显示,用2%PRP处理的髓核细胞的增殖显著增强。PRP处理显著增加髓核细胞中的CollagenⅡ和Aggrecan的mRNA水平。Western blotting结果显示,TGF-β1信号通路的特异性抑制剂可显著抑制Smad 2/3和基质蛋白的表达。在兔椎间盘退变模型中,PRP+抑制剂注射组的Smad 2/3和CollagenⅡ的表达水平显著低于PRP处理组。这些结果表明,PRP中由于TGF-β1含量高,可激活TGF-β1/Smad 2/3途径,并促进CollagenⅡ和其他基质成分的合成和分泌,从而延缓了椎间盘退变。     

柚皮苷和木犀草素联合应用对大鼠BMSCs诱导成骨过程中Wnt/β-cantein通路相关基因表达的影响

摘要 目的：探讨柚皮苷和木犀草素联合应用对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）诱导成骨过程中Wnt/β-cantein通路相关基因表达的影响。方法：取大鼠股骨中提取的BMSCs,分别建立A组（空白组）、B组给予柚皮苷溶液10 μmol/L,C组给予木犀草素溶液5 μmol/L;D组给予骨碎补总黄酮溶液10 mg/mL;E组给予柚皮苷-木犀草素混合溶液配伍比为10 μmol/L：5 μmol/L,并诱导其向成骨细胞分化。应用碱性磷酸酶（ALP）染色及分光光度法检测第7 d各组细胞ALP活性。应用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测第7 d各组细胞Wnt/β-cantein通路相关基因及成骨基因的表达。结果：B组、C组、D组、E组细胞562 nm波长下光密度（OD）值显著高于A组,E组细胞562 nm波长下OD值最高,显著高于B组、C组、D组（P＜0.05）。B组、C组、D组、E组细胞ALP、骨钙素（OCN）、Runt相关转录因子2（RUNX2）基因表达水平显著高于A组,E组ALP、OCN、RUNX2基因表达水平最高,显著高于B组、C组、D组（P＜0.05）。B组、C组、D组、E组细胞β-catenin、Cyclin D1基因表达水平显著高于A组;B组、E组LEF-1基因表达水平显著高于A组;E组β-catenin、LEF-1、Cyclin D1基因表达水平最高,显著高于B组、C组、D组（P＜0.05）。结论：柚皮苷和木犀草素均具有促进大鼠BMSCs增殖和诱导其成骨向分化的作用,柚皮苷和木犀草素联合应用诱导大鼠BMSCs增成骨作用最强,其主要机制与Wnt/β-cantein通路激活有关。     

TGF-β1通过PI3K及ERK信号通路调节肺动脉高压过程中IGFBPs蛋白表达

目的:探讨大鼠肺动脉高压(PAH)过程中TGF-β1对胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)表达调节是否依赖于PI3K及ERK信号通路。方法:取健康成年SD大鼠26只,随机分成2组:PAH组,腹腔注射1%的野百合碱,剂量为60 mg/kg;对照(C)组腹腔注射生理盐水。于4周后超声检测肺动脉平均压力,取肺组织做HE染色,应用NIS-Element系统测量中膜厚度。原代培养肺动脉平滑肌(PASMC)细胞,分别加入TGF-β1及TGF-β1中和抗体后,Western-blot检测IGFBP3,IGFBP5,Smad2/Smad3表达。加入ERK特异性抑制剂PD98059或PI3K抑制剂LY294002,检测IGFBP3,IGFBP5表达。结果:野百合碱处理4周后,肺动脉高压组的平均肺动脉压力及右室/(左室+室间隔)比值显著高于对照组。TGF-β1可显著升高IGFBP3,IGFBP5及p-Smad3的表达(P0.05),而抑制TGF-β1则可显著降低三种蛋白的表达(P0.05)。加入LY294002抑制PI3K ERK后,IGFBP3和p-Smad2两种蛋白的表达量显著下调(P0.05)。加入PD98059抑制ERK后可显著降低IGFBP3及IGFBP5的表达水平(P0.05)。结论:PAH中TGF-β1升高可通过活化Smad2/Smad3上调IGFBP3和IGFBP5的表达。TGF-β1促进IGFBP3,IGFBP5表达的作用依赖于PI3K及ERK信号通路。     

栀子苷通过TGF-β1/Smad信号通路抑制肝纤维化和肝星状细胞活化

本研究旨在观察栀子苷对肝纤维化和肝星状细胞活化的影响,并探讨其可能机制。人肝星状细胞LX-2用5 ng/mL转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)处理,并用不同浓度(0, 1, 2.5, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100μmol/L)的栀子苷联合培养,MTT法进行细胞活力测定,LX-2分别经5 ng/mL TGF-β1、TGF-β1+栀子苷(20μmol/L)处理后,用qPCR和Western blot分别检测I型胶原蛋白(collagen I)、纤连蛋白(fibronectin)、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、p-Smad2和p-Smad3基因和蛋白的表达。BALB/c小鼠用CCl₄ (25%, 1 mL/kg)诱导肝纤维化,设立对照组、CCl₄组和CCl₄+栀子苷组(40 mg/kg),4周后检测肝功能及血清肝纤维化指标,用HE和Masson染色进行组织学观察,免疫组织化学分析组织α-SMA...     

TGF-β3在动物面神经损伤后修复中的应用研究

目的:探讨外源性转化生长因子β₃（Transforrning growth factorβ₃,TGF-β₃）对动物面神经愈合的作用。方法:采用新西兰大白兔面神经损伤模型,将50 ng/μg TGF-β₃注射到神经切断嵌入的硅胶管明胶海绵内,16只成年兔随机分为1周组及3月组。两组内右侧面神经上颊支为实验组,左侧为对照组;通过GFAP（胶原纤维酸性蛋白）及Nestin（巢蛋白）等免疫组织化学染色方法进行愈合评估。结果:给予TGF-β₃的1周组Nestin及GFAP,3月组Nestin及GFAP及1周组与3月组Nestin及GFAP与对照组之间都统计学有差异。结论:在外源性TGF-β₃作用可促进内源性TGF-β₃产生或共同通过Smad通路引起神经损伤后修复标志物Nestin及GFAP的表达增加,这表明TGF-β₃在面神经的损伤后修复起促进愈合作用。     

TGF-β_2在低氧条件下诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化的研究

目的：探讨转化生长因子β2（TGF-β2）在低氧条件下诱导骨髓基质干细胞（BMSCs）向软骨细胞分化的作用。方法：无菌条件下分离Wistar大鼠股骨骨髓,采用全贴壁培养法纯化BMSCs。传6代后,将细胞随机分为3组,A组加入25 ng/mL TGF-β2在1%氧浓度条件下培养;B组加入25 ng/mL TGF-β2在21%氧浓度条件下培养;C组仅加入含10%胎牛血清的DMEM-α培养液在1%氧浓度条件下培养。3周后,通过甲苯胺蓝染色检测细胞糖胺多糖,聚合酶链反应检测Ⅱ型胶原和蛋白聚糖（Aggrecan）的表达水平。结果：骨髓细胞经换液后贴壁聚集生长,形态均一,连续传代后形态无明显改变。分组培养第1周,A、C组生长速度低于B组;第2周各组均出现不规则形态细胞,A、C组细胞形态小于B组;第3周各组均可见透明样基质,以A组最明显。3周后行甲苯胺蓝染色,A组细胞内外均可见丰富的蓝染颗粒,B、C组染色较A组略浅。A组Ⅱ型胶原的表达相对量（1.246±0.287）高于B组（0.973±0.365）、C组（0.802±0.196）,差异有统计学意义（P〈0.05）;B、C组比较无明显差异（P〉0.05）。A组Aggrecan的表达相对量（0.833±0.375）高于B组（0.724±0.173）、C组（0.602±0.091）,差异有统计学意义（P〈0.05）;B、C组比较无明显差异（P〉0.05）。结论：TGF-β2联合低氧环境可明显促进骨髓基质干细胞分化为软骨细胞。     

Pamrevlumab（FG-3019）通过p38 MAPK信号通路调控人Tenon's囊成纤维细胞的增殖、移行和表型转化

摘要 目的：本研究旨在探究Pamrevlumab（FG-3019）对人Tenon''s囊成纤维细胞（HTFs）的增殖、移行和表型转化的影响。方法：应用组织块培养法进行HTFs的原代培养,通过波形蛋白(Vimentin)和细胞角蛋白（Cytokeratin）免疫荧光染色鉴定HTFs。首先将HTFs分为9组：Control组加入等量DMEM作为阴性对照组,其他组加入不同浓度的FG-3019,使其终浓度分别为10、20、50、100、200、300、400、500 μg/mL,通过MTT法检测FG-3019对HTFs的毒性。然后将HTFs分为4组：Control组（加入等量DMEM培养48 h）、TGF-β1组（10 ng/mL的TGF-β1培养48 h）、TGF-β1+FG-3019组（10 ng/mL的TGF-β1和100 μg/mL FG-3019培养48 h）、TGF-β1+FG-3019+anisomycin组（10 ng/mL的TGF-β1、100 μg/mL FG-3019和10 μg/mL anisomycin培养48 h）。通过MTT法和EdU法检测HTFs增殖,通过伤口愈合实验评价FG-3019对HTFs移行的影响通过qRT-PCR或Western blotting检测CTGF、p38 MAPK、p-p38 MAPK、α-SMA、FN和collagen I的表达变化。结果：免疫荧光染色显示,HTFs中波形蛋白阳性表达（98.17%）,细胞角蛋白阴性表达（1.83%）。与Control组相比,200、300、400和500 μg/mL组的HTFs的细胞活力均显著降低（P<0.05）。与TGF-β1组相比,TGF-β1+FG-3019组的OD_490nm降低了19.64%,增殖指数降低了57.87%,伤口愈合率降低了56.46%（P<0.05）。与TGF-β1组相比,TGF-β1+FG-3019组的α-SMA、FN和collagen I蛋白相对表达量依次降低了70.78%、70.99%和70.04%,CTGF mRNA和蛋白相对表达量分别降低了75.83%和60.73%（P<0.05）,p-p38 MAPK蛋白相对表达量降低了70.22%（P<0.05）。与TGF-β1+FG-3019组相比,TGF-β1+FG-3019+anisomycin组的增殖、移行、表型转化、CTGF mRNA和蛋白相对表达量、p-p38 MAPK蛋白相对表达量均显著增加（P<0.05）。结论：FG-3019部分通过抑制p38 MAPK信号通路来抑制TGF-β1诱导的HTFs增殖、移行和表型转化。     

尾静脉注射骨髓间充质干细胞对1型糖尿病幼鼠的治疗作用实验研究

目的:比较尾静脉注射骨髓间充质干细胞(BMSCs)治疗1型糖尿病(type 1 diabetes,T1D)幼鼠的效果。方法:选用3周龄C57bl/c幼鼠作为受试动物,连续5 d腹腔注射50 mg/kg的链脲佐菌素(STZ),建立T1D模型;采用酶消化法联合骨片法从2周龄C57bl/c幼鼠的胫骨和股骨中分离出BMSCs;碱性磷酸酶(ALP)和油红O染色检测P3代BMSCs的诱导分化能力;流式细胞仪鉴定P3代BMSCs的细胞表型;采用生理盐水和不同剂量的BMSCs(低剂量6×10⁵cells/mL、中剂量1.2×10⁶cells/mL和高剂量2.4×10⁶cells/mL)通过尾静脉输注的方式对T1D幼鼠进行治疗,定期检测T1D幼鼠的体重、血糖变化;T1D幼鼠治疗28 d后,取其胰脏行病理学分析。结果:(1)3周龄C57bl/c幼鼠注射STZ后14 d,幼鼠表现为体重增长缓慢、血糖明显升高;(2)分离得到的BMSCs细胞呈长梭纤维状;BMSCs成骨诱导9 d,碱性磷酸酶(ALP)染色后细胞外基质有大量碱性磷酸酶表达;BMSCs成脂诱导14 d,油红O染色后细胞内有大量脂滴出现;流式细胞仪检测BMSCs细胞表型,BMSCs不表达CD31、CD34和CD45,高表达CD29、CD90和CD105;(3)T1D幼鼠经过BMSCs治疗后,其体内的血糖下降并保持稳定;H.E.和胰岛素免疫组织化学染色结果显示实验组T1D幼鼠的胰腺组织随着治疗时间的延长,其损伤的胰腺组织得到了逐步的恢复,而未经过任何治疗的T1D幼鼠,其胰腺组织的损伤在逐步加重。结论:尾静脉注射BMSCs对于T1D幼鼠有治疗效果。     

Proliferation and tenogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in a porous collagen sponge scaffold

BACKGROUND Collagen is one of the most commonly used natural biomaterials for tendon tissue engineering.One of the possible practical ways to further enhance tendon repair is to combine a porous collagen sponge scaffold with a suitable growth factor or cytokine that has an inherent ability to promote the recruitment,proliferation,and tenogenic differentiation of cells.However,there is an incomplete understanding of which growth factors are sufficient and optimal for the tenogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)in a collagen sponge-based 3D culture system.AIM To identify one or more ideal growth factors that benefit the proliferation and tenogenic differentiation of rat BMSCs in a porous collagen sponge scaffold.METHODS We constructed a 3D culture system based on a type I collagen sponge scaffold.The surface topography of the collagen sponge scaffold was observed by scanning electron microscopy.Primary BMSCs were isolated from Sprague-Dawley rats.Cell survival on the surfaces of the scaffolds with different growth factors was assessed by live/dead assay and CCK-8 assay.The mRNA and protein expression levels were confirmed by quantitative real-time polymerase chain reaction and Western blot,respectively.The deposited collagen was assessed by Sirius Red staining.RESULTS Transforming growth factorβ1(TGF-β1)showed great promise in the tenogenic differentiation of BMSCs compared to growth differentiation factor 7(GDF-7)and insulin-like growth factor 1(IGF-1)in both the 2D and 3D cultures,and the 3D culture enhanced the differentiation of BMSCs into tenocytes well beyond the level of induction in the 2D culture after TGF-β1 treatment.In the 2D culture,the proliferation of the BMSCs showed no significant changes compared to the control group after TGF-β1,IGF-1,or GDF-7 treatment.However,TGF-β1 and GDF-7 could increase the cell proliferation in the 3D culture.Strangely,we also found more dead cells in the BMSC-collagen sponge constructs that were treated with TGF-β1.Moreover,TGF-β1 promoted more collagen deposition in both the 2D and 3D cultures.CONCLUSION Collagen sponge-based 3D culture with TGF-β1 enhances the responsiveness of the proliferation and tenogenic differentiation of rat BMSCs.     

槲皮素对骨髓间充质干细胞移植联合肾移植所诱导的免疫耐受的影响

目的探讨槲皮素对骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导肾移植免疫耐受的影响。方法在对肾移植后的大鼠给予BMSCs治疗的基础上,同时给予不同剂量的槲皮素,观察其诱导免疫耐受的效果。建立大鼠肾移植模型,随机分为4组:对照组、BMSC组、MSC+高/低剂量槲皮素干预组。Western blot检测各组肾组织中Janus激活激酶(JAK)、信号转导子和转录激活子3(STAT3)、p-STAT3的蛋白表达水平,ELISA检测血清中转化生长因子β1(TGF-β1)水平。收集BMSC组肾小管上皮细胞,干扰及过表达STAT3的同时予以槲皮素干预,使用Western blot检测JAK、STAT3、p-STAT3及TGF-β1表达。采用单因素方差分析比较各组间数据差异,组间数据两两比较采用SNK-q检验。结果大鼠经肾移植后,对照组血清中TGF-β1蛋白表达(19162±223)pg/ml高于其他组,BMSC组(12 106±163)pg/ml、MSC+高槲皮素干预组(9 113±110)pg/ml、MSC+低槲皮素干预组(9 024±133)pg/ml。3组分别与对照组比较P均0.01。对照组肾组织中JAK、p-STAT3的蛋白相对表达量(1.5±0.2,10.7±0.5)均高于其他各组[MSC组(0.9±0.3,8.5±0.2;P均0.01)、MSC+高槲皮素干预组(0.7±0.2,6.1±0.3;P均0.01)、MSC+低槲皮素干预组(0.7±0.3,5.8±0.1;P均0.01)]。干扰STAT3后肾小管上皮细胞中p-STAT3和TGF-β1蛋白相对表达量(0.7±0.1,0.3±0.1)均少于其他各组[对照组(8.2±0.4,7.1±0.5;P均0.01)、槲皮素干预组(5.6±0.3,4.8±0.4;P均0.01)、空白对照组(5.7±0.3,4.5±0.4;P均0.01)]。过表达STAT3后中p-STAT3和TGF-β1蛋白相对表达量(10.5±0.6,8.4±0.5)高于槲皮素干预组[(5.7±0.3,5.4±0.3);P均0.01]和空白对照组[(6.1±0.1,5.6±0.4);P均0.01]。结论大鼠肾移植时在给予BMSCs注射的同时给予槲皮素干预,可有效地抑制免疫排斥反应,改善肾功能;JAK/STAT3/TGF-β1可能参与了槲皮素诱导的免疫调节。