极端嗜酸热古菌Acidianus manzaensis胞外硫活化蛋白质基因的筛选及鉴定

以极端嗜酸热古菌(Acidianus manzaensis)为研究对象,基于比较蛋白质组学的研究方法筛选和鉴定了13个A.manzaensis胞外与硫活化相关的蛋白质基因,并从转录水平对其进行了验证。首先通过80℃缓慢摇动水浴30 min分别对A.manzaensis在单质硫(S0)和亚铁(Fe2+)为能源底物进行生长时的胞外蛋白质进行提取,并用双向电泳(2-DE)进行分离,然后选取在S0底物下差异表达的蛋白质斑点进行串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)鉴定和生物信息学分析及功能预测,最后用实时定量PCR(RT-q PCR)对筛选得到的胞外S0活化相关蛋白基因进行转录水平的验证;最终获得了13个极端嗜酸热古菌A.manzaensis胞外活化S0相关的蛋白质基因。筛选得到的蛋白质中一半以上含有较多的半胱氨酸残基(Cys),说明胞外富含巯基(-SH)的蛋白参与了S0活化;其中谷氧还蛋白(glutaredoxin)和FAD键合氧化酶均含有-CXXC-结构域,且两种蛋白质的基因表达量较高,说明含有-CXXC-结构域的蛋白质在极端嗜酸热古菌A.manzaensis活化S0的过程中起重要的作用。     

极端嗜酸热古菌Acidianus manzaensis硫氧化模型构建

为了解极端嗜酸热古菌硫氧化代谢途径,基于Acidianus manzaensis YN-25全基因组信息,通过NCBI数据库比对初步筛选了20个可能与硫氧化相关的基因,并通过实时定量PCR(RT-qPCR)比较了所筛选基因在以单质硫(S~0)和亚铁(Fe2+)两种不同能源底物培养下的表达差异。结果表明,A.manzaensis菌中存在至少15个与硫氧化相关的基因,经过比对分析,它们包括5个编码氧化单质硫(S~0)及含硫中间产物的酶基因、4个编码末端氧化酶基因、1个编码硫酸根转运蛋白酶基因、1个编码电子传递蛋白基因,以及4个编码与硫氧化密切相关的硫还原蛋白家族(Sulfur reduction protein)的dsr E基因。基于上述实验分析结果,拟构建极端嗜酸热古菌A.manzaensis的硫氧化模型,即胞外的S~0跨膜转运进入细胞内后,经硫氧化蛋白(SOR)氧化还原生成S_2O_3~(2-),SO_3~(2-)和H_2S等含硫中间产物。接着,细胞内通过其他相关硫氧化酶的作用将这些中间产物进一步氧化,并将氧化得到的电子传递给细胞膜上的氧化型醌(Q~(2+)),使其形成还原型的醌(QH_2),QH_2最终被末端氧化酶氧化形成NADH和ATP,从而为细胞生长提供能量。     

极端嗜酸热古菌Acidianus manzaensis膜蛋白提取方法的建立及应用

以万座嗜酸两面菌(Acidianus manzaensis)为研究对象,探索并优化其膜蛋白提取方法,以优化后的方法提取该菌分别以单质硫(S0)和亚铁(Fe2+)为能源底物进行生长时的膜蛋白质,并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)研究膜蛋白在两种能源底物培养下的表达差异。首先通过80℃水浴60-70 min对A.manzaensis胞外黏附蛋白进行初步分离。其次比较了不同提取剂(Triton X-110,SDS和Triton X-114)对膜蛋白的提取效果,结果表明Triton X-114的提取效果较好,其最佳浓度为10%(w/v);比较了不同沉淀剂(三氯乙酸(TCA),丙酮,三氯乙酸/丙酮,甲醇和乙醇)对膜蛋白质沉淀的效果,结果表明TCA/丙酮的沉淀效果最不理想,会导致沉淀后低分子量蛋白发生缺失,而其他几种没有明显差别,综合比较选择较常用的丙酮作为膜蛋白提取的沉淀剂。最后基于优化后膜蛋白提取方法,分别对S0和Fe2+培养的A.manzaensis膜蛋白质进行提取及SDS-PAGE,结果发现分子量为35.6 k D和16.9 k D的蛋白只在A.manzaensis以S0生长时出现,表明这些蛋白质很可能在A.manzaensis硫氧化中发挥了重要作用;分子量为72 k D和26 k D的蛋白质在A.manzaensis以Fe2+生长时比其以S0生长时显著表达上调,表明此蛋白可能与A.manzaensis铁氧化相关。     

嗜酸氧化亚铁硫杆菌细胞色素C家族afe_0378基因转录表达差异及生物信息学挖掘

嗜酸氧化亚铁硫杆菌是一种极为重要的浸矿微生物,具有氧化各种还原性含硫物及亚铁等功能。采用实时荧光定量PCR技术及生物信息学等手段对该菌一个涉及铁硫氧化由afe_0378基因编码的细胞色素C家族蛋白CycA2进行了研究。结果表明,afe_0378基因在单质硫培养条件下转录水平是亚铁培养条件下的2.67倍。生物信息学分析表明afe_0378编码蛋白CycA2是分子质量为22.959 ku,pI为9.75的结合内膜的周质蛋白,二级结构为全α-螺旋,无β-折叠,包含2个相似结构域及N端一段跨膜疏水螺旋,属于细胞色素C4型蛋白家族。CycA2蛋白分子三维结构模建表明,双血红素与CycA2蛋白序列片段域C48-X-X-C51-H52及C149-X-X-C152-H153中的半胱氨酸共价连接。结合该菌硫代谢背景知识,推测CycA2蛋白的功能是介导细胞色素bc1复合体及终端氧化酶细胞色素aa3复合体之间的电子传递而参与硫代谢。     

蛋白质二硫键异构酶家族的结构与功能

蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）家族是一类在内质网中起作用的巯基-二硫键氧化还原酶.它们通常含有CXXC（Cys-Xaa-Xaa-Cys,CXXC）活性位点,活性位点的两个半胱氨酸残基可催化底物二硫键的形成、异构及还原.所有PDI家族成员包含至少一个约100个氨基酸残基的硫氧还蛋白同源结构域.PDI家族的主要职能是催化内质网中新生肽链的氧化折叠,另外在内质网相关的蛋白质降解途径（ERAD）、蛋白质转运、钙稳态、抗原提呈及病毒入侵等方面也起重要作用.     

三叶因子家族

三叶因子家族是一类具有特殊结构——P结构域的蛋白质家族, P结构域包含6个高度保守的半胱氨酸残基及精氨酸、甘氨酸、色氨酸和苯丙氨酸残基.半胱氨酸残基以Cys1-Cys5, Cys2-Cys4, Cys3-Cys6连接形成三个链内二硫桥.已发现多种含有P结构域的多肽,其中最引人注目的是TFF1/ pS2、TFF2/SP及TFF3/ITF,在正常组织中其主要表达位点分别为胃基底和胃体(TFF1/pS2)、胃窦深部的小凹（TFF2/SP）及小肠和大肠杯状细胞（TFF3/ITF）.TFF可能具有维持粘膜屏障和促进溃疡治愈的功能.TFF含有α折叠(α-helix),β片层(β-sheet).三叶因子家族多肽的作用机理仍处于猜测阶段,现有与粘蛋白共同作用和与受体作用两种假说.     

真核蛋白质中G-patch结构域的结构和功能研究

G-patch是广泛存在真核生物蛋白质中的保守结构域,含有六个高度保守的甘氨酸残基,推测它是一种RNA结合结构域,其功能与RNA代谢有关.     

硫氧还蛋白的共价修饰

硫氧还蛋白是细胞中普遍存在的低分子量蛋白质,为生物体所必需。硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸组成硫氧还蛋白系统,调节细胞的氧化还原状态。硫氧还蛋白不仅维持细胞的氧化还原平衡,还具有抗凋亡及促进细胞增殖等功能。原核细胞的硫氧还蛋白仅含有两个半胱氨酸残基,真核细胞的硫氧还蛋白除了活性中心的两个半胱氨酸残基外,通常还有另外的半胱氨酸残基。这些半胱氨酸残基的共价修饰使硫氧还蛋白具有了更丰富的功能。硫氧还蛋白的共价修饰包括谷胱甘肽化、巯基氧化、亚硝基化和烷基化。     

硫氧还蛋白还原酶缺陷的大肠杆菌宿主促进含半胱氨酸残基的重组蛋白可溶性表达

以人工设计的,不含半胱氨氨酸残基的三元蛋白,六聚和八聚鲑鱼降钙素融合蛋白和人尿激酶原等不同半胱氨酸残基含量的外源蛋白质为例,利用大肠杆菌硫氧还蛋白还原酶基因缺陷菌GH980（DE3 trxB^-）,探索把以包涵体形式表达的外源蛋白质变为可溶性表达的可能性及其规律。研究表明：由于硫氧还蛋白还原酶基因的缺陷所引超的细胞质氧化还原态势的变化,使一些在普通大肠杆菌宿主中以包涵 形式表达,含有半胱氨酸残基的重组蛋白,在GJ980中能在一定程度上以可溶性蛋白质形式表达;不含有半胱氨酸残基的重组蛋白在GJ980中仍以包涵体形式表达,推测重组蛋白在GJ980细胞质中形成二硫键对其正确构象的形成具有一定的作用。     

硫酸铁对嗜酸氧化亚铁硫杆菌铁代谢基因表达的影响

目的:探讨硫酸铁对嗜酸氧化亚铁硫杆菌生长及铁代谢基因表达的影响.方法:用血细胞计数板和重铬酸钾滴定法研究了不同浓度硫酸铁对嗜酸氧化亚铁硫杆菌生长的影响,采用实时荧光定量PCR技术研究了硫酸铁对嗜酸氧化亚铁硫杆菌铁代谢基因表达的影响.结果:硫酸铁对嗜酸氧化亚铁硫杆菌的生长有抑制作用,随着培养基中硫酸铁浓度的增加,抑制作用也越来越明显.实时定量PCR结果表明,用0.15 M硫酸铁刺激细菌后,实验中所涉及的铁代谢相关基因表现出相似的表达趋势.刺激10 min后,基因均发生明显的的表达上调,且表现为最大值.刺激时间延长,上调幅度逐渐减小.不同的操纵子基因表现出不同的上调幅度.结论:硫酸铁对嗜酸氧化亚铁硫杆菌的生长有明显的抑制作用,铁代谢相关基因对硫酸铁的刺激有积极的反应.     

嗜酸氧化亚铁硫杆菌中铁氧还蛋白的生物信息学分析

从NCBI数据库中下载了3种铁氧还蛋白(ACK79261.1,ACK79281.1和ACK80954.1)序列,利用网站在线预测结合软件分析,对其基本理化性质、蛋白修饰、保守结构域、亚细胞定位、二级和三级结构预测和蛋白相互作用网络等方面进行分析和预测。所得数据表明,3种蛋白质均为不稳定的亲水性蛋白质,等电点偏酸性,不含信号肽,均在细胞质中发挥作用;蛋白相互作用分析预测ACK79261.1在核酸代谢过程中发挥重要作用,ACK79281.1主要参与了细胞内的2Fe-2S簇的组装,ACK80954.1对于能量和电子传递必不可少。本研究利用生物信息学预测了铁氧还蛋白结构和功能,为后续研究嗜酸氧化亚铁硫杆菌中的电子传递过程以及菌株改良、应用推广提供理论上的依据。     

溶葡球菌酶的定点突变与PEG巯基定点修饰

为了建立聚乙二醇 (PEG) 巯基定点修饰溶葡球菌酶的方法,并检验假定连接区的突变与修饰对酶活的影响,对溶葡球菌酶的假定连接区进行了巯基聚乙二醇定点修饰研究。通过分析溶葡球菌酶的结构特征,选择两个结构域之间的氨基酸 (133-154aa) 进行定点突变引入半胱氨酸残基。使用单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺 (mPEG-MAL) 进行定点修饰,对修饰后的酶进行纯化并测定酶活性。结果表明定点突变的半胱氨酸残基PEG修饰效率高、产物单一,运用简便的Ni2+-NTA柱亲和层析法实现了一步分离,获得了高纯度的目标蛋白,但在连接区进行定点突变及PEG定点修饰后的酶活有不同程度的降低,表明假定连接区部分位点的PEG修饰会对溶葡球菌酶的催化活性产生一定影响。     

腾冲嗜酸热两面菌伴侣素ATcpnβ底物结合特性研究

嗜酸嗜热古菌腾冲嗜酸热两面菌(Acidianus tengchongensis)来源的Ⅱ型伴侣素ATcpnβ已获得晶体结构解析,其顶端结构域突触下端相应于Ⅰ型伴侣素GroEL的重要底物结合位点处的氨基酸多为极性氨基酸,将其突变为疏水性氨基酸时,突变体对变性底物的捕获能力显著增强.表面等离子共振研究表明,ATcpnβ对于化学变性底物的再折叠中间体的其捕获作用不依赖于Mg2+/ATP.前期对该伴侣素冷冻电镜观察和结构解析表明,ATP的存在并不能驱动ATcpnβ从开放构型向闭合构型转变,但是表面等离子共振研究表明,ATcpnβ对热变性过程中已经聚集的底物的捕获作用依赖于Mg2+/ATP,说明Mg2+/ATP可以介导ATcpnβ顶端结构域一定的构象变化,引起顶端结构域疏水残基的进一步暴露,从而能够与大分子聚集体紧密结合.两个方面的研究均表明,伴侣素蛋白与变性底物的结合仍然以疏水相互作用为主,并且伴侣素蛋白与变性底物的结合受Mg2+/ATP的结合调控,与伴侣素蛋白疏水面的暴露程度相关.     

神经生长抑制因子的功能结构域双体

神经生长抑制因子 (neuronalgrowthinhibitoryfactor,GIF)又名金属硫蛋白 III (metallothionein III,MT III) ,是神经系统中第一个被鉴定的具有神经元生长抑制功能的蛋白质 ,β结构域为其功能结构域。为深入系统地研究GIF及其结构域的结构与功能 ,构建了神经生长抑制因子功能结构域双体 (GIFβ β)。PCR扩增得到N端 β结构域和C端 β结构域的cDNA ,酶切后克隆入原核表达载体pGEX 4T 1,经发酵、诱导表达、亲和层析、凝血酶切和进一步纯化 ,每升菌液约可得重组GIFβ β蛋白 6 0mg。测其电泳行为、氨基酸组成、质谱、金属巯基含量等 ,证明得到了目的蛋白质。圆二色性图谱显示 ,GIFβ β拥有金属硫蛋白家族成员的特征———金属巯基簇结构域。MTT还原法测定神经元抑制活性大小为 :GIF >GIFβ β>GIFβ结构域     

混菌发酵中与普通生酮基古龙酸菌产2-酮基-L-古龙酸相关功能蛋白的研究

目的:在混菌发酵中,筛选与小菌产2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)相关的功能蛋白,并分析蛋白表达量的变化与产2-KGA的关系,寻找影响菌体代谢效率的关键性因素。方法:利用蛋白质组学技术,依据小菌产酸曲线,筛选与小菌产2-KGA有一定相关性的蛋白质,并利用生物信息学数据库,分析其改变与小菌代谢的关联。结果:获得了分辨率和重复性均良好的凝胶蛋白图谱,筛选出与小菌生产2-KGA密切相关的8个蛋白。结论:小菌产2-KGA强度与小菌体内抗氧化蛋白表达水平及糖代谢、能量代谢系统密切相关,推测有活性细胞色素C的含量可能为小菌产2-KGA的限制性因素。     

单增李斯特菌氧化还原蛋白系统研究进展

单增李斯特菌是重要的食源性病原微生物,抗氧化应激是李斯特菌生存和致病的关键机制之一。活性氧(reactive oxygen species,ROS)浓度升高会破坏氧化还原平衡,使机体处于氧化胁迫的应激状态,进而导致生物大分子如蛋白质的损伤。蛋白质中半胱氨酸等含硫氨基酸对ROS尤其敏感,半胱氨酸残基脱氢氧化生成二硫键,可以稳定蛋白质空间构象,增加蛋白质的半衰期,进而使蛋白质免受损坏。抗氧化修复通常指的是对半胱氨酸残基的氧化还原过程,即二硫键的形成与打开。硫氧还蛋白家族包含硫氧还蛋白、谷氧还蛋白和Dsb-样蛋白系统,是生物体中常见的氧化还原修复系统。本文根据现有的文献报道,结合本课题组的研究进展,对单增李斯特菌硫氧还蛋白家族进行综述,以期为完善单增李斯特菌硫氧还蛋白调控系统提供参考。     

蛋白质序列和结构的保守性与其功能的关系

以蛋白质酪氨酸磷酸酶为模型,通过序列和结构的比较,对蛋白质序列、结构的保守性与其和进化的关系问题进行了研究。结果显示,虽然在酪氨酸磷酸酶超家族分子的序列中,仅有３个与其催化功能密切相关的残基是高度保守的,但它们功能结构域的核心拓扑结构却明显类似,其中存在着βａβ和βａβａ。２个保守的结构单元;此外,它们活性位点的拓扑结构也极其相似,因此,在保持蛋白南功能方面具有重要作用的残基是高度保守的,而具维持     

山羊、绵羊MT-Ⅳ分子特性研究

金属硫蛋白(MTs)是一类低分子量、金属和半胱氨酸含量高的细胞质蛋白,哺乳动物的MTS包括MT-Ⅰ、MT-Ⅱ、MT-Ⅲ和MT-Ⅳ4种亚型,其中MT-Ⅳ只在磷状复层扁平上皮细胞中表达,相关研究报道较少.本研究根据GenBank已公布的动物MT-Ⅳ基因序列,设计出扩增山羊和绵羊MT-Ⅳ基因的特异性PCR引物MT-ⅣSP1和MT-ⅣSP2,利用RT-PCR的方法,分别从山羊和绵羊的瘤胃组织mRNA中,克隆出山羊和绵羊的MT-Ⅳ基因编码区序列(均为189bp),序列登录GenBank,获得序列号EF470251和EF624067.通过序列分析,表明山羊和绵羊两个物种MT-Ⅳ基因编码区全编码均为189 bp、编码62个氨基酸,其中绵羊的MT-Ⅳ含有20个半胱氨酸,而山羊第61位保守的半胱氨酸被色氨酸所代替.两个物种的MT-Ⅳ均不含芳香族氨基酸,含有MTs特有的C-X-C、C-X-X、C-C-C-X-C-C结构,无明显的跨膜结构域,无信号肽,是一种细胞质蛋白.二级结构分析表明两个物种的MT-Ⅳ二级结构大多数为无规则卷曲结构,分别在第7～9和第49～51氨基酸残基性存在折叠结构,不存在螺旋结构.三级结构预测结果表明两个物种MT-Ⅳ的三级结构由α和β两个结构域组成,其中β结构域相同,α结构域山羊少一个半胱氨酸残基,其结构与绵间存在明显差异,这一差异可能对山羊MT-Ⅳ的生理功能产生一定影响,有必要深入研究.     

免疫球蛋白超家族分子在神经系统中的分布及功能

免疫球蛋白超家族(immunoglobulin su-perfamily,IgSF)分子是以基因和分子水平上的结构相似性为分类依据,在氨基酸组成上与免疫球蛋白可变区(V区)或恒定区(C区)有较高同源性的蛋白分子。根据IgSF结构域中Ig折叠方式、两个半胱氨酸之间氨基酸残基的数目以及与IgV区或C区同源性的程度,IgSF结构域可分为V组、C络组和C2组。V组结构域的两个半胱氨酸之间含65—75个氨基酸残基,2个β片层区共有9个反平行β折叠股;C1组     

三叶肽：从结构到功能

三叶结构域是一段由38－39个氨基酸组成的多肽序列,其中包含6个高度保守的半胱氨酸残基,这6个半胱氨酸残基以1－5,2－4,3－6的交联方式形成三对二硫,窝囊鑫肽链折叠成特征性的三叶结构。已发现的哺乳动物三叶肽有三种：pS1、SP及ITF。三叶肽通常位于消化道腔面的粘膜层,具有保护和修复功能,在维持粘膜的完整性中发挥着重要作用。