腰带长体茧蜂毒液器官和卵巢的形态学及其超微结构

应用超薄切片和电镜技术,观察内寄生蜂腰带长体茧蜂Macrocentrus cingulum Brischke毒液器官和卵巢的形态结构。腰带长体茧蜂毒液器官由1个毒囊和2条毒腺组成,毒腺接于毒囊的顶端。毒腺由单层分泌细胞、退化的外胚层细胞和环腔的内膜构成,分泌细胞主要由1个明显的细胞核和1个较大囊状细胞器构成,囊状细胞器的功能是分泌毒液。毒囊由肌肉鞘和扁平细胞层构成,但没有分泌细胞。腰带长体茧蜂卵巢1对,每个卵巢由10条左右卵巢小管组成,与侧输卵管相接处略微膨大形成卵巢萼区。2条侧输卵管在产卵管基部会合形成1条总输卵管与产卵管相接。毒液器官通过毒囊的毒液导管附着在总输卵管上。对寄生蜂毒液器官的生物学、细胞学及在分类进化上的意义进行研究。     

黄腹潜蝇茧蜂寄生因子的特性及其对寄主的生理效应

初步研究了黄腹潜蝇茧蜂Opius caricivorae Fischer寄生因子的特性及其对寄主美洲斑潜蝇Liriomyza sativae Blanchard幼虫的生理效应。黄腹潜蝇茧蜂携带的主要因子是毒液。毒液器官是由一个土黄色的锥形毒囊和7个透明的椭圆形的毒腺及导管构成的;毒液的电泳图谱显示约有12条蛋白带,其中绝大多数低于100 kD,含量最高的3条蛋白带为43.5、25.9和20.1 kD;杜氏腺约有15条左右蛋白质条带,其中有5条含量很高（121.4、77.0、51.5、42.7和36.5 kD）。通过透射电镜观察,在黄腹潜蝇茧蜂毒腺分泌细胞和卵巢表皮细胞中新发现存在一种类病毒颗粒,这些球状颗粒直径大约为50 nm。雌蜂经Co60辐射处理后再寄生（即假寄生）3龄寄主幼虫,被寄生后的寄主依然能正常化蛹,但不能羽化;7 h后寄生体壁开始出现红斑;脂肪体形态结构无显著变化;绝大多数的蜂卵没有被包囊。推测在正常寄生的情况下可能是毒液抑制了寄主的包囊作用,而新发现的类病毒颗粒是否参与了这一过程目前还不清楚。     

半闭弯尾姬蜂寄生及其毒液对小菜蛾幼虫血细胞吞噬作用的影响

半闭弯尾姬蜂Diadegma semiclausum是小菜蛾Plutella xylostella的优势内寄生蜂, 拥有毒液、多分DNA病毒（PDV）等寄生因子,能有效调控寄主幼虫的营养生理和免疫系统, 但其毒液在这过程中的功能不明。本文利用SDS-PAGE方法分析了半闭弯尾姬蜂毒液的蛋白组分,利用寄主幼虫血细胞体外原代培养的方法,研究了小菜蛾幼虫血细胞噬菌能力在半闭弯尾姬蜂寄生后的变化情况。结果表明：半闭弯尾姬蜂毒液蛋白分子量主要集中在35~220 kDa之间,少数小于15 kDa,但分子量处于35~70 kDa之间的蛋白含量较高,与其他寄生蜂毒液蛋白相似。半闭弯尾姬蜂毒液单独对寄主小菜蛾幼虫功能血细胞（浆血细胞和颗粒血细胞）的延展能力和吞噬功能不产生破坏作用。但半闭弯尾姬蜂寄生后短时间内,寄主功能血细胞的延展受到抑制,然而功能血细胞仍然能识别外源异物, 却无法进一步吞噬外源物; 寄生后24 h,功能血细胞的延展力恢复,颗粒血细胞的吞噬作用可顺利完成。本研究证明了半闭弯尾姬蜂寄生能暂时性地抑制颗粒血细胞的延展性从而影响其噬菌过程。     

西伯利亚鲟致病性嗜水气单胞菌外膜蛋白及其抗原性分析

采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)法提取西伯利亚鲟嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)外膜蛋白,电泳显示所提取的主要外膜蛋白分子量为26～120 kDa;为比较该菌株与气单胞菌菌属其他细菌外膜蛋白组分及抗原性异同,以致病性豚鼠气单胞菌(A.caviae)、温和气单胞菌(A.sobria)和无致病力的嗜水气单胞菌为对照,电泳图谱显示4种气单胞菌外膜蛋白的分子量主要集中在26～120 kDa之间;利用抗西伯利亚鲟嗜水气单胞菌血清的免疫印迹试验表明该菌株外膜蛋白中分子量为75 kDa、52 kDa、43 kDa、40 kDa、34 kDa、28 kDa的蛋白条带呈现阳性反应,其他3种气单胞菌外膜蛋白中均有与该抗血清反应的条带,且分子量为28 kDa、34 kDa的反应条带为4株菌共有;43 kDa与75 kDa反应条带为部分菌株共有.为进一步筛选和研究致病性气单胞菌的共同保护抗原提供参考.     

蝶蛹金小蜂毒液蛋白不同提取分离方法的比较

为了建立蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum毒液抑制寄主血细胞免疫活性组分合适的分离纯化方法,就等电点沉淀法、乙醇沉淀法、75%硫酸铵沉淀法、75%硫酸铵沉淀法+40℃加热处理法,以及75%硫酸铵沉淀法分别与3种不同滤膜的分子大小截留法的组合等7种方法对毒液蛋白分离效果及活性的影响进行了比较。结果表明：等电点沉淀法获得的组分抑制寄主菜粉蝶Pieris rapae离体血细胞延展和包囊的活性最强,乙醇沉淀法次之,75%硫酸铵沉淀法最弱。从蛋白组分的SDS-PAGE图谱来看,等电点沉淀法获得毒液组分相对最纯,仅有3条主要谱带,分子量大小在45～116.2 kDa范围内;乙醇沉淀法次之,有5条主要谱带,分子量大小在24～116.2 kDa范围内;硫酸铵沉淀法的谱带组成与毒液蛋白粗提液相似。3种分子大小截留法获得的毒液组分的活性分析表明,强活性组分分子量大小可能都大于100 kDa。综合认为,7种方法中以等电点沉淀法提取分离蝶蛹金小蜂毒液蛋白相对为最适。     

颈双缘姬蜂毒液对寄主小菜蛾的免疫抑制作用

对颈双缘姬蜂Diadromus collaris (Gravenhorst)及其毒液引起寄主小菜蛾Plutella xylostella的一些生理效应进行了研究。结果表明,颈双缘姬蜂寄生寄主后可引起寄主小菜蛾蛹总血细胞及浆血细胞和颗粒血细胞数量的上升。寄生后1天观察,血细胞延展行为受到影响,表现在颗粒血细胞放射状丝的产生及浆血细胞伪足的形成受到抑制。通过毒液对寄主离体幼虫血细胞延展行为、形态及活性影响的研究,发现毒液抑制了寄主离体浆血细胞的延展,但对颗粒血细胞的影响不明显;毒液引起寄主浆血细胞和颗粒血细胞的破裂和死亡,毒液对寄主幼虫血淋巴酚氧化酶活性有一定的抑制作用,当反应至40、60及80 min时,毒液处理和未经毒液处理的寄主血淋巴在490 nm处的吸光值差异比较明显。对毒液蛋白成分的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析发现,毒液中有9种多肽,分子量介于9～50.2 kD,其中50.2、30.5、28.2、25.1 和12.6 kD的多肽含量较高, 与其他蜂毒液的一些作用已知的蛋白条带相似,因而推测它们同样具有免疫及发育抑制作用。结果证明颈双缘姬蜂毒液能破坏寄主细胞及体液因子调节的免疫反应。     

腰带长体茧蜂寄生对亚洲玉米螟幼虫体内酚氧化酶活性的影响

通过对被腰带长体茧蜂Macrocentrus cingulum Brischke寄生的5龄亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis Guenée幼虫体内不同组织中酚氧化酶活性的测定,采用体外注射腰带长体茧蜂雌性成蜂的萼液成分、毒液成分、萼液与毒液混合物的方法,研究了寄生蜂各种主要生理因子对寄主血清中酚氧化酶活性的影响。结果表明： 寄生蜂寄生可明显抑制寄主体内的酚氧化酶活性,减少黑色素产生;被寄生组FITC标记的血细胞阳性百分率低于未被寄生组,差异极显著( P<0.01）;萼液成分可明显地抑制亚洲玉米螟幼虫血清中酚氧化酶的活性 （P<0.01）;萼液与毒液混合物对酚氧化酶活性也有明显抑制作用（P<0.01）。研究认为寄生蜂产卵时注入的萼液、毒液可对寄主昆虫酚氧化酶活性产生明显的抑制作用,其中萼液是抑制寄主免疫能力的主要因素。     

杀虫蛋白Vip3Aa11对亚洲玉米螟及其寄生性天敌腰带长体茧蜂的影响

【目的】本文的研究目的是明确杀虫蛋白Vip3Aa11对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis及其寄生性天敌腰带长体茧蜂Macrocentrus cingulum的影响。【方法】首先利用生物测定的方法用含100μg/g Vip3Aa11蛋白的人工饲料饲喂亚洲玉米螟初孵幼虫,7 d后观察记录亚洲玉米螟的死亡情况和体重。然后用含100μg/g Vip3Aa11蛋白的人工饲料饲喂被腰带长体茧蜂寄生的亚洲玉米螟初孵幼虫,以含6μg/g印楝素的人工饲料作为阳性对照,10 d后记录亚洲玉米螟幼虫的死亡和被寄生情况,并在茧蜂化蛹结茧及羽化后分别记录茧重以及单个寄主的出蜂量,以此评价Vip3Aa11蛋白对腰带长体茧蜂的间接影响。再者,用含100μg/g Vip3Aa11蛋白的20%蜂蜜水饲喂腰带长体茧蜂成虫,以含100μg/g印楝素的20%蜂蜜水作为阳性对照,观察记录腰带长体茧蜂成蜂的死亡情况;不同处理的腰带长体茧蜂寄生亚洲玉米螟10 d后记录亚洲玉米螟的死亡和被寄生情况,并在子代茧蜂化蛹结茧及羽化后记录茧重及单个寄主的出蜂量,以此评价Vip3Aa11蛋白对腰带长体茧蜂的直接影响。【结果】生物测定结果显示,100μg/g的Vip3Aa11蛋白处理7 d后亚洲玉米螟幼虫的平均死亡率为50.7%,平均体重抑制率为77.1%。间接影响试验结果显示,被腰带长体茧蜂寄生后的亚洲玉米螟幼虫取食含有Vip3Aa11蛋白的人工饲料后死亡率明显升高,腰带长体茧蜂茧重和单头出蜂量大幅度下降,而寄生率及羽化后的成虫寿命没有受到不利影响。直接影响试验结果显示,腰带长体茧蜂取食含有100μg/g Vip3Aa11蛋白的蜂蜜水对腰带长体茧蜂成虫寿命和寄生率、亚洲玉米螟幼虫死亡率以及腰带长体茧蜂子代的茧重、单头出蜂量和成虫寿命均没有产生不利影响。【结论】本研究利用生测体系从直接和间接两方面评价了Vip3Aa11蛋白对腰带长体茧蜂的影响,结果表明腰带长体茧蜂对高于Bt作物中表达的Vip3Aa11蛋白浓度不敏感,Vip3Aa11蛋白不会对腰带长体茧蜂产生直接的不利影响;造成的间接影响可能主要是由于寄主自身质量的下降而引起。     

管氏肿腿蜂毒液精氨酸激酶基因的克隆与表达分析

为了解精氨酸激酶作为寄生蜂毒液蛋白的功能,本研究克隆了管氏肿腿蜂毒液精氨酸激酶基因的开放阅读框,分析其表达特征,并测定了该毒液蛋白在毒液中的酶活性。克隆获得的毒液精氨酸激酶基因的开放阅读框长1 068 bp,编码了355个氨基酸,其理论分子量为39.71 kDa,等电点为5.86,并具有精氨酸激酶典型的N端和C端结构域,以及精氨酸和ADP结合位点、ATP-胍基磷酸转移酶活性位点和高度保守的天冬氨酸和精氨酸残基。系统进化分析表明,膜翅目精氨酸激酶分为两个亚家族,管氏肿腿蜂精氨酸激酶属于亚家族1。荧光定量PCR分析结果显示,该毒液蛋白基因在卵、幼虫、蛹、雌成虫中的表达量逐渐上升,至羽化10 d时达最高。在不同组织中,该基因在头部和毒液器官中的表达量较高。通过酶活测定发现,管氏肿腿蜂毒液中精氨酸激酶的酶活性为5.18 U/g蛋白。该研究有助于今后揭示寄生蜂毒液精氨酸激酶的功能与作用机制。     

蚜虫全蛋白提取方法的比较研究

为建立适于SDS-PAGE分析的蚜虫蛋白质样品制备平台,以便为蚜虫蛋白质的双向电泳分析奠定基础,本研究比较了TCA/丙酮沉淀、PEG提取、饱和酚抽提和直接裂解4种蛋白质提取方法.结果表明:不同样品制备方法的蛋白提取率有显著的差异,其中直接裂解法的提取率最高,为17.43 mg/g;其次是饱和酚抽提法,提取率为12.30 mg/g;而PEG制备法提取率最低,只有7.96 mg/g.利用SDS-PAGE电泳对不同的蛋白质样品进行了分析,发现在凝胶图谱上显现的条带也有明显的差异,其中饱和酚抽提法显现的条带数最多,为36条,且从14.4 kDa～116.0 kDa范围有广泛分布,条带清晰;PEG提取法条带数为30条,一些蛋白条带丢失或不明显;TCA/丙酮沉淀法的蛋白条带集中分布在25.0 kDa～67.0 kDa区域;直接裂解法条带数仅为24条,且小分子量的条带可辩率很低.通过以上结果可以得出,饱和酚抽提法最适用于蚜虫全蛋白样品的制备.