伯克霍尔德菌HQB-1抑制香蕉枯萎病菌的活性化合物分离鉴定

【背景】伯克霍尔德菌HQB-1对香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cubenseTropical Race 4,Foc TR4)具有良好的防治效果。【目的】从菌株HQB-1发酵液中分离活性化合物并通过超高效液相联用质谱进行检测,获得该菌株具有良好生防作用的单体化合物。【方法】以HQB-1为目标菌株,大批量发酵并进行发酵液分离、提纯,通过超高效液相联用质谱法与核磁共振波谱法鉴定活性化合物。【结果】HQB-1菌株发酵液中的蛋白对Foc TR4无抑制作用;HQB-1菌株产生儿茶酚型铁载体,而不产生异羟肟酸型铁载体;对HQB-1菌株发酵液离心、浓缩、干燥,获得乙酸乙酯浸膏(粗提物),经过大孔树脂柱的充分吸附,在30%、60%及无水甲醇的洗脱下获得组分1-3,对Foc TR4的抑菌率分别为10.06%、27.82%和51.40%;选择抑菌率最大的组分3过硅胶柱层析,获得黄绿色晶体。该化合物在365 nm波长下具有最大吸收峰,将核磁共振图谱与SciFinder和SDBS信息数据库进行图谱比对,将该抑菌活性化合物鉴定为吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-Carboxylic Acid,PCA)。PCA对Foc TR4的最小抑菌浓度最低,仅为1.563μg/mL,说明PCA对Foc TR4的抑制效果较强。【结论】从HQB-1菌株中分离得到活性化合物PCA,PCA的发现为香蕉枯萎病的生物防治奠定了良好的理论基础。     

尖镰孢古巴专化型Focr4-1701突变体的生物学表型研究

由尖镰孢古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)引起的香蕉枯萎病是香蕉生产中的毁灭性病害之一。Foc有4个小种,其中4号小种(Focr4)因其寄主范围广且无高抗病性的香蕉品种,对香蕉产业的危害最大,其致病机制至今尚不清楚。为研究其致病机制,本文对Focr4野生型菌株(Focr4-193-6)、因其T-DNA插入导致致病性严重减弱的突变体Focr4-1701、T-DNA插入标签基因敲除子△Focr4-1701及敲除基因互补子△Focr4-1701-cp-1为材料,从致病性测定、玻璃纸穿透试验、孢子形态观察、产孢量与孢子萌发率测定、粗毒素测定等方面对其与致病性相关的生物学表型进行了测定。结果表明:T-DNA插入突变体Focr4-1701和基因敲除突变体△Focr4-1701接种后的香蕉植株叶片没有表现发病症状,敲除基因互补菌株与野生型菌株一样表现出发病症状;T-DNA插入突变体和基因敲除突变体不能穿透玻璃纸生长,T-DNA插入突变体及基因敲除突变体在产孢量、孢子萌发率和产毒素能力上均极显著低于野生型菌株及互补菌株。这些表型性状差异说明Focr4-1701致病性严重减弱可能是T-DNA插入位点标签基因失活后导致了菌丝体侵染能力下降及产毒素能力降低造成的。     

表达抗α毒素单链缺本基因工程菌株的构建

将2种抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体（ScFv)基因ScFv-2E3和ScFv-1A8分别克隆至表达质粒pUC119,pET-20b,pET-28a和pHOC21中,构建了重组质粒,分别转化至相应的受体菌JM105,BL21（DE3）和XL1-BLUE中,得到表达ScFv的重组菌株,ELISA和SDS-PAGE分析检测表明：经IPTG诱导后所表达的ScFv目的蛋白主要形成了包含体的形式,但也有少量ScFv存在于重组菌株的培养上清和胞周质中,经薄层扫描分析;重组菌株XL1-BLUE（pHOG-2E3)的蛋白表达产物分别占菌体可溶性蛋白的4%,重组菌株XL1-BLUE（pHOG-2E3)的蛋白表达产物占菌体总蛋白的相对含量为22%,其相对分子量约为31ku。表达的ScFv蛋白不但具有中和卵磷脂酶的活性,而且能够对致死性腹腔攻击α毒素的小鼠产生良好的被动保护作用。     

蜡状芽孢杆菌HY-1的生长及对毒死蜱的酶促降解特性

为明确毒死蜱降解菌—蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) HY-1的生长和粗酶液对毒死蜱的降解特性, 采用种子液中定量添加毒死蜱和测定粗酶比活力的方法, 研究了含毒死蜱的种子液培养基中菌株的生长规律和环境因素对粗酶液降解毒死蜱的影响。结果表明: 含毒死蜱的培养液和空白对照相比菌株生长的适应期延长, 对数期、稳定期顺序后延。随着培养液中菌体数量的增长, 培养液的pH也随之升高。粗酶液中可溶性蛋白的含量为2.21 g/L, 测得粗提酶中其米氏常数Km为1.235 6 mmol/L, 最大降解速率Vm     

几种尖孢镰刀菌专化型中SIX1、SIX4、SIX6、SIX8同源基因分析

尖孢镰刀菌在与寄主的相互作用中分泌几个特定的富含半胱氨酸的小分子量蛋白进入木质部中启动致病力,被称为SIX(secreted in xylem)蛋白,为明确其在不同寄主中的作用,本研究比较分析了几种尖孢镰刀菌专化型中SIX1、SIX4、SIX6、SIX8同源基因序列。根据已完成的尖孢镰刀菌古巴专化型1号(Foc1)与4号生理小种(Foc4)全基因组测序序列信息及相关SIX基因序列设计引物,应用PCR方法扩增分析56株尖孢镰刀菌古巴专化型与18株其它专化型及非致病型尖孢镰刀菌菌与其它种或属共21株菌株中的SIX1、SIX4、SIX6、SIX8基因。结果表明:设计的SIX1、SIX4、SIX6、SIX8基因引物均不能从非致病性尖孢镰刀菌与其它镰刀属种或其它属的菌株DNA中扩增出目的条带;SIX1基因的2个引物均能从供试的Foc菌株DNA中扩增出目的条带,同时可从部分其它专化型菌株DNA中扩增出目的条带;SIX4基因引物仅能从供试的尖孢镰刀菌番茄专化型与部分甘蓝专化型菌株DNA中扩增出目的条带;SIX6引物仅能从供试Foc1、Foc2、Foc4菌株DNA中扩增出目的条带;SIX8基因引物能从所有供试的致病尖孢镰刀菌中DNA扩增出目的条带。研究发现的SIX6基因序列提供了快速鉴定尖孢镰刀菌古巴专化型的检测方法,同时为深入研究尖孢镰刀菌各个专化型中SIX基因的功能奠定基础。     

棉花根际固氮菌、解磷菌及解钾菌的相互作用

目的通过对棉花根际促生细菌N2126、P1108和K2116菌株单独接种和混合接种,根据这些菌株的固氮、解磷、解钾能力和细胞数量的变化,了解它们之间的相互作用。方法将这3株菌株设置4个不同的组合:N2126+P1108、P1108+K2116、N2126+K2116及N2126+P1108+K2116,分别测定培养液中全氮含量,水溶性磷、钾含量和细胞数量。结果P1108对N2126的生长有促进作用但抑制K2116的生长,N2126和K2116之间存在拮抗作用。N2126、P1108和K2116混合培养后,三者细胞数量分别占培养液中细胞总数的6.4%、89.2%和4.4%;培养液中的全氮含量比不接种时下降了0.7%;水溶性磷、钾含量比不接种时分别增加了19.0%和12.2%。结论P1108为3株菌株混合培养时的优势菌株,3株菌株混合培养有助于磷、钾释放。     

球形芽孢杆菌C3-41菌株杀蚊毒素的提取及其同源性研究

从球形芽孢杆菌C3-41菌株芽孢-晶体复合物中分别提取孢壁蛋白(S蛋白)和孢晶毒素。采用SDS-PAGE证明孢晶毒素具有43和40kD两种多肽。但S蛋白只有一条104kD的蛋白带。后者经NaOH处理迅速降解成43和40kD的多肽。S蛋白和用SephadexG-75提纯的孢晶毒素对三龄致倦库蚊幼虫的LC50值(48h)分别为267和10ng／ml。免疫双扩散试验证明2362,1593、Bs-10(H5a5b)和2297(H25)菌株的孢晶毒素能与C3-41菌株的孢晶毒素抗血清发生交叉反应,但K(H1)、SSH-1、1404(H2)和2315(H26)菌抹的孢晶毒素与此抗血清不发生交叉反应。同时还证明Cr41菌株的S蛋白和孢晶毒索具有抗原同源性。     

重金属铜抗性菌株的筛选及其生物学特性的研究

通过在培养基中加入一定浓度的Cu(CuSO4·5H2 O ,Cu 2 0 0mg·L-1) ,从 4 2份土壤样品中筛选得到 2株具有很强Cu抗性的细菌B和G ,经初步鉴定它们分别属于无色细菌属和芽胞杆菌属。将菌株B和G接种到添加Cu(15 0mg·L-1)的培养液中进行沉淀态铜的活化试验 ,结果表明 ,与不接菌对照相比 ,B和G菌株分别使培养液中有效铜含量增加 4 75 5 %和 2 4 9 5 % ,培养液pH由 6 5分别降低到 4 2和 5 0 ,菌株B和G的活化效能与其代谢产酸有关。B菌株和G菌株最适生长温度为 2 8℃ ,最适 pH分别为 6～ 7和 8,G菌株在 5 %NaCl下生长良好。除抗Cu外 ,两株菌对重金属Pb(40 0mg·L-1)、Cd(10 0mg·L-1)也具抗性。     

大丽轮枝菌毒素的分离、提纯及生物测定

试验用Czapek's培养液培养大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)不同致病力类型的5个菌株的培养滤液,经浓缩、离心和透析制成的粗毒素,再经DEAE-纤维素柱层析得到初提毒素,最后通过琼脂糖凝胶过滤层析获得纯毒素样品。生物活性测定表明初提毒素的最低生物活性浓度为5.0—5.5μg/ml。纯毒素的最低生物活性浓度为4.0—4.5μg/ml。配制相同浓度的不同致病力类型菌株的毒素液,它们的培养滤液、粗毒素或纯毒素对棉苗的致萎能力相同。     

鸭跖草叶点霉粗毒素的提取方法和产条件的研究

以石油醚、乙酸乙酯、四氯化碳三种极性不同的溶剂对鸭跖草叶点霉病原菌的菌丝和培养液进行萃取，获取粗毒素。结果表明，叶点霉菌产生的毒素既有胞外毒素，又有胞内毒素，且用极性中等的乙酸乙酯萃取效果最好。大豆培养基和PSK分别是适合菌株生长和毒素分泌的固体培养基和液体培养基。确定有利于叶点霉产毒的温度为32℃、培养时间为14d、培养方式为150r/min振荡培养。     

pH值对香蕉枯萎病菌4号生理小种生长的影响

【背景】香蕉枯萎病菌4号生理小种(镰刀菌)是香蕉产业的致命威胁。已有研究表明土壤pH值越高,香蕉枯萎病发病率越低,但是现有pH值对镰刀菌影响的研究大都是用强酸强碱调节pH值,pH值没有缓冲体系保护,而且尚未检测试验终点时介质的pH值。此外,关于pH值对香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)影响的研究尚不系统,难以用于指导生产实践。【目的】为系统地了解土壤酸碱度对Foc4生长的影响。【方法】在pH 3.0-11.0之间设定9个pH值梯度,模拟酸性到碱性土壤pH值条件,于室内培养条件下系统研究pH值对Foc4生长、产孢、孢子萌发的影响及其生长过程对环境pH值的影响。【结果】弱酸性至中性环境(pH 5.0-7.0)最适宜于香蕉枯萎病菌的生长、产孢和孢子萌发。弱碱性处理(pH8.0和pH9.0)孢子平均萌发率较弱酸性环境处理(pH5.0和pH6.0)下降了73.1%。与pH 6.0酸性处理相比,pH 8.0和pH 9.0处理的产孢量分别下降了52.3%和68.1%。【结论】香蕉枯萎病菌Foc4生长和萌发过程会产酸,但是在缓冲体系液体培养基中,除了pH 9.0和pH10.0处理终点培养液pH值分别下降了0.34和0.27个单位外,其它处理起始和终点的pH值无差异。说明在缓冲体系液体培养基中的研究结果可以反映环境pH值对Foc4生长和萌发的影响。在作物可以生长的pH值范围内(pH5.0-9.0),碱性和微碱性条件(pH8.0-9.0)能明显抑制Foc4生长、产孢和孢子萌发。     

香蕉枯萎病菌Argonaute基因功能分析及其调控小RNA发生

尖孢镰刀菌古巴专化型Fusarium oxysporum f.sp.cubense是威胁香蕉生产的重要土传病原真菌,其中4号生理小种(Foc4)能感染几乎所有的栽培品系.Argonaute蛋白(AGO)介导的RISC复合体在RNAi干扰中起到重要作用.Foc4含有两个进化上高度保守的AGO蛋白,本研究利用同源重组技术获...     

韭菜对香蕉枯萎病菌生长及香蕉枯萎病发生的抑制作用

结合实验室抑菌试验和大棚人工接菌盆栽试验,研究韭菜对香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc4)的拮抗作用及其对香蕉枯萎病发生的防控效果.结果显示:离体条件下,韭菜粗提取液显著抑制Foc4菌丝的生长,造成菌丝变形、细胞的解体;也能显著抑制孢子的萌发并导致孢子失去活性.大棚盆栽试验中,韭菜处理的巴西香蕉苗枯萎病发病率降低70%,病情指数降低86.9%;韭菜处理的广粉1号粉蕉苗枯萎病的发病率降低76.7%,病情指数降低93.4%.研究表明,韭菜对Foc4有很高拮抗效果,而且对香蕉枯萎病有很高的防控作用.     

链格孢菌粗毒素对菊花‘神马’幼苗生长及生理代谢的影响

由链格孢菌引起的菊花黑斑病严重降低了菊花的品质和产量.链格孢菌在代谢过程中分泌的粗毒素是菊花黑斑病发生的主要致病因子之一.本文从菊花黑斑病发病叶片中分离筛选出致病真菌链格孢菌1株,研究其粗毒素对菊花幼苗‘神马’生长的影响以及测定盆栽幼苗叶片细胞膜相对透性、抗性物质含量、诱导酶活性及代谢物质含量变化.结果表明: 链格孢菌粗毒素对菊花‘神马’幼苗的株高、茎粗、根长均有抑制作用,毒素浓度与抑制效果呈正相关,且粗毒素原液处理14 d后,菊花幼苗株高、茎粗、根长受到显著抑制,分别比对照减少了28.9%、21.4%和23.3%;链格孢菌粗毒素处理菊花‘神马’幼苗后,根系组织细胞膜透性随着毒素浓度的增加而增加,在同一毒素浓度处理下,菊花幼苗叶片细胞膜透性随着处理时间的增加呈先增大后降低的趋势;毒素原液处理菊花幼苗后,菊花幼苗叶片中抗性物质可溶性蛋白、丙二醛(MDA)以及脯氨酸含量均显著提高.链格孢菌10倍稀释液处理对叶片苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性的提高最为显著.链格孢菌粗毒素对切花菊‘神马’幼苗的致病作用主要通过抑制菊花幼苗根、茎的正常生长,增加菊花幼苗叶片细胞膜透性,影响切花菊幼苗叶片中抗性物质代谢以及提高叶片保护酶活性而影响植株正常生理代谢.     

赤霉病麦中毒研究Ⅳ.赤霉病麦粗毒素的致畸与致突变研究

通过酒精提取、丙酮浓缩,从天然带毒的赤霉病元麦中制备粗毒素。化学分析表明既含脱氧雪腐镰刀菌烯醇,又含玉米赤霉烯酮。以此粗毒素0,125,250,500,1,000mg/kg体重于孕期7—16天连续灌胃授予Wlstar妊娠大鼠。结果发现:1,000mg/kg有明显的胚胎毒作用;250rag/kg以上有胎儿毒作用和致畸作用。另以不同浓度的粗毒素柱层析纯化物和脱氧雪腐镰刀菌烯醇纯品测试了对鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型菌株的致突变性。结果表明:加与不加S-9混合液均有诱变性,但存在着一定的剂量-反应差异。     

金龟子绿僵菌及其粗毒素对樟巢螟幼虫的致病性

【目的】为了筛选感染樟巢螟Orthaga achatina幼虫的高致病力金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae菌株,并研究绿僵菌粗毒素对幼虫的毒力和取食粗毒素后幼虫的血淋巴细胞免疫反应。【方法】以死亡率 时间几率值法和TDM模型分析绿僵菌及其粗毒素对樟巢螟幼虫的致病力,并显微观察处理幼虫的血淋巴细胞的变化。【结果】绿僵菌菌株Ma1291-2对樟巢螟幼虫有较强的致病力,以浓度(1.0±0.5)×108个孢子/mL的孢子悬液接菌11 d后,幼虫的校正死亡率和僵虫率分别为99.8%±2.6%和86.9%±1.3%,LT₅₀为6.29 d。各菌株产粗毒素水平与其对幼虫的校正死亡率和LT₅₀呈显著相关。通过时间-剂量-死亡率模型参数估算,Ma1291-2菌株及其粗毒素对幼虫致死效应较强的时间段分别为接菌后6-7 d和3-4.5 d。幼虫取食绿僵菌粗毒素后2 d,总血细胞、浆血细胞、珠血细胞和类绛血细胞浓度上升到最高值,而后下降;粒血细胞浓度2 d后开始极显著上升,第3天达到最高值后急速下降;原血细胞前3 d未发现有明显的数量变化,第4天显著下降。幼虫取食粗毒素3~4 d后,浆血细胞和粒血细胞有破裂,珠血细胞和类绛血细胞有黑化现象,原血细胞病态变化不明显。【结论】樟巢螟幼虫取食绿僵菌粗毒素后2-3 d,幼虫血淋巴细胞对粗毒素的免疫反应最强烈,且粗毒素对血细胞有毒害和破坏作用。本研究为该害虫的生物防治提供了一定的理论与应用基础。     

氨基酸影响尖孢镰孢菌古巴专化型厚垣孢子的形成

香蕉枯萎病是由尖孢镰孢菌古巴专化型Fusarium oxysporum f. sp. cubense（Foc）侵染引起的一种土传真菌病害,已严重威胁香蕉产业的健康发展。该病菌产生的厚垣孢子可在土壤中存活多年,是香蕉枯萎病的初侵染源。本研究通过氨基酸添加试验,证明添加甘氨酸可抑制厚垣孢子的形成;通过对该病菌厚垣孢子形成前期、初期、中期和后期的转录组分析,发现氨基酸合成通路中有93个基因的表达水平在厚垣孢子形成过程中发生了显著变化;In silico 分析表明其中10个基因参与调控真菌的氨基酸合成,11个基因参与调控真菌种的生长发育和产孢,19个基因参与调控真菌种的致病性和毒素产生。由此推测,氨基酸合成通路不仅与尖孢镰孢菌古巴专化型厚垣孢子的形成相关,其有可能参与调控该病菌的致病性。     

基于多基因序列分析对尖孢镰孢菌古巴专化型（香蕉枯萎病菌）生理小种的鉴定

由尖孢镰孢菌古巴专化型Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc引起的香蕉枯萎病是香蕉生产上的毁灭性病害,自1996年以来已对我国华南地区香蕉生产造成了严重危害。传统上香蕉枯萎病菌生理小种的鉴定主要采用人工接种鉴别寄主尔后测定病菌致病性的方法,但实验周期长,且受季节影响。以来自澳大利亚的香蕉枯萎病菌生理小种1号（BW1）、2号（Race 2）、3号（Race 3）以及亚热带4号（BW4）为对照,对分离自我国华南地区主要香蕉产区（广东、广西、海南、福建等省区）的14株香蕉枯萎病菌的单孢菌株进行致病性测定,并结合热带4号小种（TR4）和亚热带4号小种（ST4）的分子特异检测方法,确定其生理小种类型;同时,利用ITS、TEF-1α、IGS、histone H3、β-tubulin等 5个主要用于镰孢菌系统发育学研究的基因,研究不同地区不同来源的Foc菌株之间的亲缘关系及其与非病原尖孢镰孢菌的关系,并评价这5个基因在香蕉枯萎病菌生理小种鉴定上的应用价值。研究结果表明：（1）来源于我国华南地区的4号小种主要为热带4号小种;（2）TEF-1α、IGS、histone H3等3个基因片段能够将Foc中不同生理小种的菌株划分成不同的系统发育谱系,与致病性测定的结果具有对应关系,也能较好地反映尖孢镰孢菌种内菌株的亲缘关系,可用于香蕉枯萎病菌生理小种鉴定;（3）我国Foc 1号生理小种的遗传多样性高于4号生理小种,Foc 1号生理小种的菌系与来自香蕉果实上的非病原尖孢镰孢菌的亲缘关系比其与Foc 4号生理小种的菌系的亲缘关系更近。     

霍乱毒素B亚单位基因（CtxB）的克隆及其表达

从霍乱弧菌中抽提基因组ＤＮＡ,用ＰＣＥＲ方法获取霍乱毒素Ｂ亚单位基因（ＣｔｘＢ）。序列分析结果表明,ＣｔｘＢ基因编码１２４个氨基酸,其中编码６２位Ｔｈｒ的密码子与文献报道有差异。将ＣｔｘＢ基因插入质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－２,构建ｐＧＥＸ－ＣＴＸＢ表达质粒,转化大肠相菌ＢＬ２１（ＤＥ３０,筛选表达菌株ＣＴＸＢ／ＢＬ２１。工程株经ＩＰＴＧ诱导表达,可产生大量的表达蛋白,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,融合蛋白分子