梭梭NAC转录因子HaNAC38、HaNAC42克隆及表达分析

本研究从梭梭中克隆得到2个NAC转录因子,分别命名为Ha NAC38和Ha NAC42。Ha NAC38读码框长879 bp,编码292个氨基酸;Ha NAC42读码框长582 bp,编码198个氨基酸。序列比对显示Ha NAC38和Ha NAC42均含有NAC家族的A、B、C、D、E保守结构域。荧光定量PCR分析结果显示,梭梭(Haloxylon ammodendron,H.ammodendron)幼苗中Ha NAC38和Ha NAC42基因在干旱、高盐、IAA、ABA处理以及高温胁迫条件下的表达模式并不完全相同,为进一步研究梭梭NAC转录因子功能和调控机制打下基础。     

梭梭14-3-3蛋白基因HaFT-5、HaFT-6克隆及表达分析

14-3-3蛋白是生物体内重要的调节蛋白,对细胞代谢及循环、信号传导、转录调节、蛋白跨膜转运、以及生物胁迫和非生物胁迫等多种生理过程均有重要的调节作用。本研究用RT-PCR从梭梭中克隆2个14-3-3蛋白基因,分别命名为Ha FT-5、Ha FT-6。用q RT-PCR分析Ha FT-5、Ha FT-6基因在不同处理后的表达。研究显示,Ha FT-5全长501 bp,编码139个氨基酸;Ha FT-6全长647 bp,编码226个氨基酸。在干旱、高盐、ABA、IAA处理后梭梭Ha FT-5和Ha FT-6基因后呈现不同的表达模式。综上所述,这2个基因可以响应逆境胁迫和2种激素信号,本研究可为进一步探索梭梭的抗逆分子机制提供了理论基础。     

梭梭肌动蛋白基因HaACT1全长的克隆与表达分析

根据本实验已克隆得到的梭梭肌动蛋白基因Ha ACT1部分序列,通过5'RACE技术获得HaA CT1的cDNA全长序列。序列分析表明,该基因c DNA全长序列1 534 bp,其中5'UTR序列为75 bp,3'UTR序列为325 bp,开放阅读框序列为1 134 bp,编码376个氨基酸。该序列与Gen Bank中收录的其它植物Actin基因核苷酸序列的相似性均在84%以上,并且它们的氨基酸序列的相似性达95%以上,Gen Bank登录号为KM886609。根据得到的c DNA序列设计全长引物,进一步克隆了Ha ACT1的基因组DNA序列,由4个外显子和3个内含子组成。利用半定量和绝对荧光定量PCR对Ha ACT1的表达进行分析,发现该基因在梭梭的不同组织及各种非生物胁迫下均能稳定表达,适合作为梭梭中其它功能基因表达研究中的内参基因。     

梭梭NAC转录因子家族基因的克隆和转录激活分析

以梭梭NAC转录组测序结果设计特异引物,成功克隆5个梭梭NAC转录因子。通过与其它物种NAC蛋白进行多重比对,表明克隆的5条序列具有NAC转录因子所共有的5个典型亚结构域。通过构建p GBKT7融合表达载体,将其转入AH109酵母菌中进行转录激活功能分析。结果显示含有Ha NAC10、Ha NAC17、Ha NAC18、Ha NAC21转录因子的重组酵母菌可以在SD-Trp-His-Ade缺陷培养基平板上生长,X-gal检测显蓝色。这表明Ha NAC10、Ha NAC17、Ha NAC18、Ha NAC21可以激活下游报告基因表达,说明其具有转录激活活性;Ha NAC16不具备转录激活活性。为进一步分析梭梭NAC转录因子功能和调控机制提供帮助。     

蜜蜂表皮蛋白apidermin (apd)基因家族3个新成员的特性鉴定及昆虫APD家族序列特征的分析

Apidermin (APD)蛋白家族是一个新的昆虫结构性表皮蛋白家族。本研究结合生物信息学和RT-PCR扩增, 对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica（简称“意蜂”）的apd-1-like, apd-3-like和中华蜜蜂Apis cerena cerena（简称“中蜂”）的apd-2 等3个新的apd基因的结构特征和表达进行了分析, 并分析了昆虫APD蛋白家族的序列特征。结果显示, 在西方蜜蜂Apis mellifera（简称“西蜂”）中, apd基因家族的6个成员串联排列在基因组序列第4号连锁群上, 它们在A. m. ligustica雄蜂头部中的转录水平差异明显, 且其启动子序列所含顺式元件也不同。中蜂apd-2和意蜂apd-1-like都含有3个外显子和2个内含子, 而意蜂apd-3-like则由4个外显子和3个内含子组成。蛋白序列分析结果显示, 目前已知的10条APD蛋白序列N末端均具有相似的信号肽序列, 其成熟蛋白分子量为6.0~37.0 kD, pI为6.2~10.8。其中西蜂的APD1-3、APD-like和东方蜜蜂Apis cerena的APD-2等5条较短的多肽中疏水氨基酸残基达52%~67%, 且Ala含量最为丰富（占25%~34%）; 而丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis的APD 1-3和西蜂APD-1-like, APD-3-like等另外5条APD多肽富含Gly（21%~30%）, 其序列中疏水氨基酸残基含量为35%~41%。多肽序列多重比对和系统进化分析结果显示, APD家族可划分为2个亚家族。亚家族Ⅰ含有西蜂APD 1-3和东方蜜蜂APD-2等4条较短的多肽序列, 其N末端为一个长33 aa的保守基序; 亚家族Ⅱ由另外6条相对较长的多肽序列组成, 其N末端保守基序长50 aa, C末端保守基序长16 aa。本文所描述的APD蛋白家族序列特征有助于以后从其他昆虫中鉴定新的apd基因。     

葡萄NAC转录因子家族生物信息学分析

NAC基因家族是植物所特有的一类重要转录因子,广泛参与植物生长、发育以及器官建成、逆境胁迫应答等反应.目前,基因组信息的挖掘和分析已经成为葡萄功能基因组学研究的重要组成部分.本文利用生物信息学方法对葡萄143条NAC蛋白序列的系统发生和NAC基因组定位进行分析,然后对其氨基酸组成成分、理化性质以及二级和三级结构进行预测和分析,同时还分析了葡萄与拟南芥的NAC基因家族之间的联系.结果显示这143条蛋白序列与拟南芥94个NAC基因蛋白序列一起分成了16个亚族,说明拟南芥与葡萄NAC基因间具有较高的保守性.基因组定位结果发现143条NAC基因分布在17条染色体上.研究还发现不同亚家族间氨基酸数目、氨基酸序列间的疏水性存在一定的差异;而它们的二级结构都主要以随机卷曲为组成部分,且143条氨基酸序列三维结构十分相似.本文试验结果将为葡萄NAC基因家族的进一步功能分析提供重要研究基础.     

慈竹中2个NAC转录因子的克隆与分析

基于慈竹转录组数据库,从慈竹笋克隆得到2个NAC基因,分别命名为BeNAC3(GenBank登录号KU821587)和BeNAC4(GenBank登录号KU821588),在生物信息学分析的基础上,研究了2个基因的组织表达模式和转录活性。TMHMM软件和系统进化分析表明,BeNAC3和BeNAC4都有一个明显的跨膜结构域,可能是膜结合蛋白,且两者分别与NAC2亚家族和ANAC011亚家族有较高相似性。根据BeNAC3在笋、未展开叶、展开叶和茎中的相对表达量,及其在进化树中与NAC2亚家族近似的亲缘关系,推测其可能与激素合成调控及开花有关;而BeNAC4基因在成熟组织中表达量明显高于幼嫩的笋和未展开叶,表明其可能参与慈竹的次生生长发育调控。酵母单杂活性实验分析表明,BeNAC3和BeNAC4都能够激活β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的表达,表明这2个基因均具有一定的转录活性。该研究结果为今后获得转基因慈竹植株功能的验证奠定了一定的基础。     

2个慈竹NAC转录因子的克隆与组织表达分析

以慈竹转录组数据为基础,结合毛竹基因组数据,采用同源克隆技术从慈竹中克隆到两个NAC基因Be NAC1(Gen Bank注册号:KU550706)和Be NAC2(Gen Bank注册号:KU821586),分别编码313和389个氨基酸残基。蛋白功能域预测和保守结构域多重对比分析表明,Be NAC1和Be NAC2基因均含有NAM保守域,其模拟的蛋白质三维结构与已知晶体结构的水稻模型蛋白高度相似。亚细胞定位预测分析显示,Be NAC1主要集中在细胞质中;Be NAC2则主要集中在细胞核中。表达分析表明,Be NAC1和Be NAC2具有相似的组织特异性表达,在茎中表达量均明显高于笋和叶片,且Be NAC1在除笋之外各组织中的表达量均显著高于Be NAC2。     

梭梭中HaDREB2A的克隆与表达分析

脱水响应元件结合蛋白(DREB)转录因子在应激反应相关基因的调控中起重要作用。本研究利用RT-PCR方法从梭梭组织中获得Ha DREB2A基因开放阅读框(ORF)全长(Gen Bank登录号为:KP765243)。生物信息学分析表明,该基因ORF长1 083 bp,编码360个氨基酸,蛋白的分子量为40.5 k D,理论等电点(p I)为5.07,该蛋白在90(K)~143(R)区域含有一个典型的AP2保守结构域。通过物种间系统发育树可以看出Ha DREB2A与Sb DREB2A进化关系最接近,二者属于同一进化分支。半定量RT-PCR表达模式分析显示,该基因在梭梭同化枝、根、茎、花和种子中均有表达,且在同化枝中的表达量最高,并且受干旱、高盐和外源ABA的诱导。     

西方蜜蜂表皮蛋白基因apd-like转录起始位点的定位及cDNA序列的分析

Apidermin蛋白家族是根据蜜蜂表皮蛋白apidermin 1-3（APD 1-3）而命名的一个新型的昆虫结构性表皮蛋白家族。为了鉴定西方蜜蜂Apis mellifera基因组序列上毗邻基因簇apd 1-3的一个预测基因座LOC727145是否为一个新的apd基因,本研究在用5′LongSAGE标签定位该基因的转录起始位点（TSS）的基础上,利用其中的3条5′LongSAGE标签序列作为上游引物,通过RT-PCR方法克隆了该基因的cDNA序列（GenBank登录号： GU358197, GU358199, GU358198）。生物信息学分析发现,基因座LOC727145含有2个外显子和1个“GT-AG”型内含子,其cDNA序列富含GC（70％）,可编码一条长152 aa残基的高度疏水性多肽。此多肽序列的氨基酸组成与蜜蜂APD 1-3表皮蛋白类似, 富含Ala, Gly, Pro, Leu 和Val 5种氨基酸（占77％）, 其中Ala残基含量最高（29％）。该多肽序列与蜜蜂APD-1表皮蛋白序列的相似性为50％, 且其N末端的预测信号肽序列与APD 蛋白的信号肽序列类似。5′LongSAGE标签的基因组定位结果显示,基因座LOC727145在雄蜂头部中表达丰度很高,RNA PolⅡ可从6个不同的TSS上以不同效率起始转录,其中由一个优势TSS上起始了90％的转录。本研究为apidermin表皮蛋白家族增添了一个新成员, 命名为apidermin-like (apd-like)。     

紫花苜蓿NAC转录因子MsNAC1基因的克隆、生物信息学分析及非生物逆境胁迫下的表达分析

NAC转录因子是高等植物所特有的具有多种生物功能的转录因子,在植物生长发育、抵抗逆境和激素调节等过程中发挥着重要作用。本研究利用RACE-PCR技术,克隆获得了紫花苜蓿NAC转录因子Ms NAC1(Gen Bank登录号为JN099384.1)基因的c DNA序列。生物信息学分析显示,Ms NAC1基因的开放阅读框(ORF)为993 bp,编码一个由330个氨基酸残基组成的亲水性蛋白,N-端具有保守的NAM结构域,C-端高度变异,具备NAC转录因子的基本特征;Ms NAC1蛋白被定位在细胞核中,含有2条核定位信号序列,具有9个糖基化位点和23个磷酸化位点,三级结构为对称的同型二聚体。多重比对发现,Ms NAC1蛋白与拟南芥ATAF1和水稻Os NAC6蛋白的同源性较高;系统进化分析表明,Ms NAC1蛋白属于NAC转录因子家族中的ATAF亚族,与ATAF1的亲缘关系最近。非生物逆境胁迫下的表达分析显示,Ms NAC1基因在高盐、干旱和低温胁迫下表达量均呈现先上调后下调的趋势,不同处理时间的差异达到极显著水平,并且根中的表达量上调幅度高于叶片,说明该基因可能参与调控非生物逆境胁迫的生理响应。     

巴西橡胶树HbNAC24基因克隆和表达分析

该研究以巴西橡胶树为实验材料,从橡胶树胶乳cDNA中克隆了NAC转录因子基因(HbNAC24)完整开放阅读框(ORF),并通过酵母实验和实时荧光定量PCR技术,进行转录激活活性分析和表达分析。结果显示:(1)HbNAC24基因ORF为1 167bp,编码388个氨基酸,在N端第7~174氨基酸之间含有一个典型的NAC结构域。(2)酵母实验表明,HbNAC24具有转录激活活性,转录激活区在高度变异C端,具备了NAC转录因子的基本特征。(3)序列比对和系统进化分析表明,HbNAC24蛋白属于NAC转录因子家族中的TIP亚族。(4)实时荧光定量PCR分析结果发现,HbNAC24基因在叶中的表达量显著高于其他部位;割胶和茉莉酸(JA)处理均能够诱导HbNAC24表达上调。研究认为,HbNAC24基因可能参与植物的生长发育和胁迫应答过程。     

绵羊CAST基因2型和4型转录本的克隆及特性分析

钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin, CAST)是一种内源性的需要Ca²⁺激活的钙蛋白酶抑制剂, 在肌肉组织的蛋白质降解过程中起重要的调节作用。文章利用牛^CAST基因的mRNA序列, 通过逆转录RT-PCR首次克隆获得绵羊CAST基因2型转录本和4型转录本的部分cDNA序列, 并对序列进行生物信息学分析。CAST基因2型转录本的扩增片段为4 385 bp, 完整的开放阅读框为2 361 bp, 编码786个氨基酸; CAST基因4型转录本的扩增片段为1 467 bp, 完整的开放阅读框为1 317 bp, 编码438个氨基酸。CASTⅡ型蛋白序列存在4个保守结构域, CASTⅣ型蛋白序列存在3个保守结构域; 两者的二级结构均以螺旋为主, 富含疏水区域, 其氨基酸序列存在多个磷酸化位点以及蛋白激酶C(Protein kinase C, PKC)的磷酸化位点。通过RT-PCR分析CAST基因2型转录本和4型转录本的组织表达谱, 结果表明CAST基因2型转录本在所检测的10个组织中均表达, CAST基因4型转录本仅在睾丸组织中表达。     

小麦TaNAC5基因克隆及表达分析

NAC转录因子在植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着重要作用。该研究利用RACE技术从小麦中克隆了1个NAC基因TaNAC5(HQ650113.1)。序列分析显示,TaNAC5基因开放阅读框(ORF)924bp,编码307个氨基酸。多序列比对和进化树分析显示,TaNAC5基因所编码的蛋白具有NAC家族蛋白的保守结构域,与玉米ZmNAC5有较近的亲缘关系。实时荧光定量PCR分析显示,TaNAC5基因的表达显著受渗透胁迫、低温胁迫、乙烯和双氧水诱导,而受高盐胁迫和ABA抑制。研究表明,TaNAC5参与非生物逆境胁迫及相关信号分子的应答。     

青杨脊虎天牛CYP4G2基因片段的克隆、序列分析与表达

根据报道的十几种昆虫CYP4家族基因的氨基酸序列保守区域设计一对引物,利用RT-PCR技术扩增编码青杨脊虎天牛Xylotechus rusticus中肠细胞色素氧化酶CYP4G2蛋白的cDNA片段,构建原核表达载体pET-CYP4G2,将其转化入大肠杆菌Escherichia coli JM109中表达。序列分析结果表明,该基因(CYP4G2,GenBank登录号为EF429250)保守区域阅读框全长387 bp,编码129个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为16.9 kD和5.75;推导的氨基酸序列与已报道的昆虫CYP4家族氨基酸序列一致性较高（63%～86%）,且具有细胞色素氧化酶的典型特征。IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳检测到一条22 kD大小的外源蛋白,与预测融合蛋白的分子量大小相应。CO差光谱分析证明重组菌表达了有活性的pET-CYP4G2。     

棉花两个β-甘露糖苷酶cDNA的克隆及其特征

从陆地棉纤维cDNA文库中分离出两个B-甘露糖苷酶的cDNA克隆,GhManAl和GhManA2.它们的开放读码框编码长度分别为834个氨基酸和976个氨基酸的多肽序列,这两个多肽C-末端的747个氨基酸残基是完全一致的,而N-末端的序列差异较大.GhManAl和GhManA2均属于糖基水解酶家族2的成员,它们与其它植物来源的该家族中β-甘露糖苷酶之间具有较高的同源性,而与非植物来源的β-甘露糖苷酶之间的同源性较低,但不同蛋白序列中均存在糖基水解酶家族2的酶催化活性所需的两个Glu保守残基.这两个多肽的N-末端均没有信号肽序列,因此可能为胞内酶.从表达特征来看,GhManA1属于组成型表达基因,而GhManA2则为纤维细胞优势表达基因.     

棉铃虫章鱼胺受体2基因的分子鉴定

【目的】为了探讨章鱼胺受体2基因(Octopamine receptor 2,OA2B2)在棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)体内表达谱及激素对其调控作用,为今后研究Ha OA2B2受体基因在转录调控中的作用,开发新型杀虫剂提供一定的理论依据。【方法】本实验采用QRT-PCR技术、激素处理、RNAi介导的蜕皮激素相关核受体沉默等方法对Ha OA2B2受体基因在棉铃虫不同发育阶段及组织中的表达谱与激素调控进行探究。【结果】生物信息学分析表明,Ha OA2B2受体基因编码框长度1 191 bp,编码396个氨基酸。Ha OA2B2受体基因氨基酸序列与家蚕Bombyx mori一致性高达89%。Ha OA2B2受体基因在棉铃虫各时期均有表达,尤其在5龄第3天转录水平达到最高;Ha OA2B2受体基因在棉铃虫幼虫头部表达量最高。蜕皮激素可促进Ha OA2B2受体基因的表达。【结论】分析了该基因的序列特征和表达谱,蜕皮激素对其表达量的影响,为今后研究Ha OA2B2受体基因在转录调控中的作用以及开发新型杀虫剂提供一定的理论依据。     

巴西橡胶树HbNAC1基因的克隆和表达分析

根据EST序列信息,利用RACE技术从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中克隆了1个NAC类转录因子基因HbNAC1,其cDNA全长为1419 bp,含有完整的开放阅读框,编码309个氨基酸。推导的氨基酸序列含有1个NAM结构域,具有典型的NAC类蛋白的结构特征,与毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)、水稻(Oryza sativa)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)中的相应氨基酸序列的同源性分别达79%、80%、57%和60%。聚类分析表明,HbNAC1属于NAC家族Ⅱ亚族。半定量RT-PCR分析表明,该基因在胶乳中的表达较丰富,经乙烯利刺激后其在胶乳中的表达量明显增加。     

茶树中2个NAC转录因子基因的克隆及温度胁迫的响应

利用茶树转录组数据库,检索得到2个NAC家族转录因子基因CsNAC1和CsNAC2。通过RT-PCR方法,将其从茶树‘迎霜’中分离克隆,利用荧光定量PCR方法,对CsNAC1和CsNAC2基因在‘迎霜’和‘安吉白茶’2个茶树品种不同组织以及温度胁迫处理下的表达进行分析,以探讨NAC家族转录因子在温度胁迫下的响应特征。结果表明:(1)CsNAC1和CsNAC2基因开放阅读框长度分别为1 044和1 047bp,分别编码347个和348个氨基酸;蛋白功能域预测和多重对比显示,CsNAC1和CsNAC2蛋白N端均含有典型NAC家族成员所具有的NAM保守结构域。(2)进化分析表明,CsNAC1和CsNAC2分别属于NAC家族的NAP和AtNAC3亚家族。(3)三维分子模型建模显示,CsNAC1和CsNAC2蛋白分别含有3个和2个α-螺旋,6个和7个β-折叠。(4)荧光定量PCR结果显示,CsNAC1在2个茶树品种中具有较相似的组织特异性,均在茶树成熟叶中表达量最高;CsNAC2则分别在‘安吉白茶’的幼叶中,‘迎霜’的根中表达量最高;高温(38℃)和低温(4℃)处理下,CsNAC1和CsNAC2基因的表达均受不同温度胁迫影响,不同茶树品种、不同时间段的表达存在差异。     

玉米ZmNAC99基因的克隆及干旱诱导表达分析

以不同抗旱性玉米自交系为材料,克隆得到玉米ZmNAC99基因的gDNA序列和cDNA序列,并对其进行了初步的生物信息学分析,同时结合RT-PCR和qRT-PCR技术对其在不同干旱程度下的表达模式进行了分析。结果显示:(1)ZmNAC99基因的gDNA长1 892~1 908bp,cDNA长1 188bp,共编码395个氨基酸,其N-端具有保守的NAM结构域;系统进化分析表明推断的ZmNAC99蛋白属于NAC家族中的OsNAC3亚类。(2)RT-PCR和qRT-PCR分析表明,干旱胁迫诱导下ZmNAC99表达上调;顺式元件分析进一步揭示了ZmNAC99基因的推断启动子包含2个干旱应答顺式元件MBS和1个低温应答元件LTR。(3)不同抗旱性玉米自交系来源的ZmNAC99推断氨基酸序列存在4个氨基酸突变,推测其结构差异对玉米抗旱性可能产生一定影响。研究表明,ZmNAC99可能在植物的抗逆过程发挥作用。