鱼类β-防御素的研究进展

β-防御素是一种具有六个保守的半胱氨酸位点的阳离子两亲性小分子多肽,是抗菌肽的重要成员。随着基因组学研究的不断深入,目前在鱼类中发现了20个β-防御素基因,其基因结构均是由3个外显子和2个内含子组成,并且具有广谱抗菌活性及抗病毒活性。主要从分子结构、组织分布、基因结构、生物学活性以及生物进化等方面对鱼类β-防御素的研究概况进行综述。     

景东湍蛙抗菌肽jindongenin-1d的分析和活性测定

新型抗菌肽研究有助于解决细菌对抗生素的耐药性问题。本研究用SMART技术构建了景东湍蛙Amolops jingdongensis皮肤的全长cDNA文库。通过单克隆和测序获得一个抗菌肽cDNA序列,序列比对结果表明其属于jindongenin-1家族,命名为jindongenin-1d。其cDNA序列全长321bp,编码含66个氨基酸残基的多肽。该多肽包括1个信号肽和1个前肽序列。成熟jindongenin-1d多肽包含24个氨基酸残基,理论分子量为2 709.38,等电点为9.24。对人工合成的jindongenin-1d蛋白进行了抗菌和溶血活性分析,结果表明jindongenin-1d对所选的革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌均有显著抑制作用,同时有弱溶血活性。本研究结果有助于进一步了解两栖动物皮肤分泌物活性物质的多态性和新型抗感染药物的设计。     

牛气管黏膜抗菌肽成熟肽基因的克隆及序列分析

目的:获得牛气管黏膜抗菌肽(bTAP)成熟肽的基因序列,为后续的研究工作奠定基础。方法:从新屠宰的黄牛气管黏膜中提取总RNA,反转录获得cDNA,以此cDNA为模板进行PCR扩增目的片段,并将其克隆至pMD18-T载体中,经鉴定随机挑选1个阳性重组子进行测序,将测序结果与已报道的序列进行比较,并做NCBIBlast比对。结果:PCR扩增出bTAP成熟肽基因,核苷酸序列测定验证了其正确性;NCBIBlast比对表明,与bTAP成熟肽基因同源性较高的分别是牛β-防御素11、牛β-防御素12、牛β-防御素402、牛β-防御素403、绵羊β-防御素1、绵羊β-防御素2、山羊β-防御素1及山羊β-防御素2,核苷酸序列同源性分别为78.07%、78.95%、80.70%、83.33%、83.33%、80.70%、81.58%和81.58%,氨基酸序列同源性分别为68.42%、65.79%、68.42%、76.32%、71.05%、63.16%、63.16%和68.42%。结论:成功克隆了bTAP成熟肽的基因序列,NCBIBlas比对表明bTAP与防御素可能来自一个共同的祖系基因。     

梭梭NAC转录因子HaNA C3～4的克隆及表达分析

本研究从梭梭中克隆了2条NAC基因,分别命名为序列Ha NAC3(KU534095)和Ha NAC4(KU534-096)。序列分析显示Ha NAC3基因编码一条242个氨基酸的多肽,Ha NAC4基因编码一条287个氨基酸的多肽,并且编码的蛋白都为亲水性蛋白。经过同源性比对分析发现2条序列都含有典型的NAC结构域,属于NAC转录因子家族。组织特异性表达分析结果显示Ha NAC3序列在梭梭根部有较高强度的表达;Ha NAC4在梭梭种子中表达量较高。干旱胁迫下,Ha NAC3和Ha NAC4呈现出不同的表达方式,本研究有助于为进一步分析梭梭NAC家族基因功能提供帮助。     

Gateway技术构建菊芋块茎全长cDNA文库及EST测序分析

为丰富菊芋功能基因组学研究基础平台,以成熟期菊芋块茎为材料,将菊芋全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了菊芋非剪切型全长cDNA文库。文库质量分析表明:未经扩增的原始文库库容量为5.76×10~6 CFU,插入片段大小主要为1～3000 bp,重组率为100%(24/24),达到了高质量文库的标准。利用该文库进行表达序列标签(expressed sequence tag, EST)测序,得到2639条高质量的EST序列,拼接后获得1895条非重复的唯一表达序列(unigene)。与NCBI的NR数据库同源比对分析表明,共有1533条unigene(80.9%)与已知基因有显著的同源性。GO分类结果显示:菊芋块茎表达基因在分子功能类群中,结合和催化活性所占比例最高。此cDNA文库将可用于菊芋功能基因组研究、新基因筛选、高通量EST测序以及菊芋cDNA芯片的制备等。     

荷斯坦奶牛中性粒细胞β-防御素cDNA的克隆与序列分析

为研发牛β-防御素生物制剂,防治奶牛乳腺炎。根据已发表的牛β-防御素基因序列设计一对引物。收集患乳腺炎奶牛乳静脉血液中性粒细胞,用试剂盒提取总RNA。经RT-PCR扩增牛β-防御素cDNA片段,回收纯化PCR产物,连接pMD18-T载体,转化感受态细胞JM109。在含X-Gal、Amp及IPTG的LB平板上筛选阳性克隆,经菌落PCR及双酶切鉴定后,对目的片段进行测序。结果表明RT-PCR扩增出的cDNA片段碱基数为189bp,含有一个完整的ORF,能编码63个氨基酸的多肽,多肽中含6个保守半胱氨酸残基。用Blast程序进行检索比较,表明扩增序列与GenBank中发表的BNBD-7编码区序列96.3%相同。结果成功克隆出奶牛β-防御素家族的成员BNBD-7基因,为重组牛β-防御素的开发奠定了基础。     

西伯利亚蝗抗菌肽基因的克隆及表达特性研究

[目的]扩增西伯利亚蝗Gomphocerus sibiricus抗菌肽(attacin)基因,并对其进行生物信息学分析,同时分析西伯利亚蝗不同组织中抗菌肽基因的差异表达.[方法]基于RACE技术从西伯利亚蝗中克隆得到抗菌肽,利用生物信息学软件对西伯利亚蝗抗菌肽的一级结构、二级结构、三级结构、系统进化和亚细胞定位进行分析.采用实时荧光定量PCR技术检测了西伯利亚蝗抗菌肽基因在马氏管、中肠、后肠、脂肪体和唾液腺中的相对表达量.[结果]克隆获得的抗菌肽基因的开放阅读框为282 bp,编码93个氨基酸,其编码蛋白预测理论分子量为9.98 ku,等电点为9.26.抗菌肽氨基酸序列中存在信号肽序列.基因定量分析显示,抗菌肽基因在西伯利亚蝗的中肠中表达量最高.[结论]attacin在西伯利亚蝗成虫不同组织中差异表达,提示其消化道在防御病原微生物的入侵中起着重要的作用.     

基于illumina测序的厚壳贻贝足组织转录组研究

贻贝足丝是贻贝足组织分泌的足丝蛋白形成的非细胞组织,具有在水环境下的极强粘附性能,是当前生物粘附剂及抗腐蚀材料的研发热点．为进一步了解贻贝足丝蛋白的分子多样性特征,采用新一代Illumina高通量测序平台对厚壳贻贝(Mytilus coruscus)足组织进行转录组测序,首次构建了厚壳贻贝足组织的转录组数据库．共计获得7 199 799 840 nt的碱基数据经过序列拼接和组装,获得88 825条unigene．对上述unigene开展了序列注释,共计37 007条unigene获得注释．在此基础上,经序列检索和比对,从中筛选出与目前已知的11种足丝蛋白同源的56条unigene序列并进行分析．结果表明,厚壳贻贝足丝蛋白具有明显的氨基酸偏好性,部分足丝蛋白具有重复序列,且厚壳贻贝足丝蛋白与其他种类的贻贝足丝蛋白具有较高的序列相似性．上述结果为后续贻贝足丝蛋白的批量鉴定以及在此基础上的贻贝足丝形成、固化以及粘附机制相关研究奠定了基础．     

β-葡聚糖刺激下的斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)转录组分析

斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)是一种重要的海水经济养殖鱼类,然而病害是制约其养殖产量的一个重要因素。近年来-葡聚糖作为一种新型的天然免疫增强剂在水产养殖业中得到广泛应用。本研究采用腹腔注射0.2 mL-葡聚糖(浓度0.05 g/mL)刺激斜带石斑鱼,在刺激6 h、72 h后分别取头肾、血液淋巴细胞、胸腺和脾脏组织进行转录测序。结果一共组装了175 568条unigene,平均长度是1 507 bp。通过Blast比对数据库进行功能注释,一共注释了121 629条unigene。六大数据库注释得到的unigene数量分别为:91 955条(Nt)、66 089条(Nr)、14 126条(GO)、24 018条(COG)、9 673条(KEGG)和54 148条(Swiss Prot)。根据基因差异表达分析筛选出6类免疫相关的显著性差异基因71个,涉及抗原加工呈递、细胞粘附分子、补体系统、细胞因子、模式识别受体和吞噬作用。对差异基因进行GO富集分析,筛选出免疫相关条目7条,包括免疫应答、B细胞受体信号通路、趋化因子受体活性、白细胞趋化性、趋化因子调节信号通路、白细胞介素-1受体绑定和溶酶体组份。随机挑选7个显著性差异的免疫基因进行qRT-PCR验证,验证结果与测序结果变化趋势一致。本实验结果为研究-葡聚糖调节鱼类免疫系统的作用机制提供数据参考。     

小菜蛾Gloverin like抗菌肽对蝉拟青霉侵染的响应研究

抗菌肽是昆虫天然免疫的重要成分,在抵御病原物的侵染中发挥着重要的作用。昆虫Gloverin抗菌肽是一类仅在鳞翅目昆虫中存在的富含甘氨酸抗菌肽。本研究在转录组测序的基础上对小菜蛾抗菌肽gloverin like基因进行了克隆,其开放阅读框序列全长519 bp,编码172 aa,信号肽为1-17 aa。序列分析表明其序列中甘氨酸的比例为15%,与鳞翅目昆虫Gloverin抗菌肽具有较高的同源性。qRT-PCR结果表明小菜蛾抗菌肽gloverin like基因在脂肪体和血细胞组织中表达量较高。蝉拟青霉、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌均可诱导小菜蛾抗菌肽gloverin like基因上调表达,蝉拟青霉诱导12 h后表达量达到最高。利用LC-MS方法在蝉拟青霉侵染的小菜蛾幼虫血淋巴中鉴定出小菜蛾Gloverin like、Gloverin抗菌肽以及Lysozyme II、Transferrin、Prophenoloxidase等抗菌效应蛋白。与对照相比,蝉拟青霉侵染后小菜蛾Toll通路4个免疫基因(βGBP、Toll、Cactus和Dorsal)表达量上升。本研究在抗菌肽方面为进一步研究小菜蛾抵御病原真菌入侵的分子机制提供基础信息,也为新的害虫防治方法提供了思路和靶标。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.