盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶基因克隆及其蛋白质结构预测

本文通过对盐生杜氏藻（Dunaliella salina）cDNA文库进行大规模EST测序并结合RACE实验克隆了盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶基因,并且通过Southern blotting实验确定了该基因在这个物种中拷贝数。通过生物信息学的方法,预测该基因所编码的蛋白质结构,验证了该蛋白质具有3-磷酸甘油脱氢酶完整的功能性结构域和磷酸水解酶类结构域。本实验为解释盐生杜氏藻在面临高渗胁迫下快速合成甘油的机制提供了帮助。     

SOEing 法构建EGFP真核表达载体及其在杜氏盐藻中的表达

通过重叠区扩增基因拼接法（Gene splicing by overlap extension,SOEing）构建含有杜氏盐藻（Dunaliella salina）硝酸盐还原酶（NR）基因5′-上游序列（Pnr）and 3′-端序列（Tnr）的EGFP真核表达载体,并将其转化杜氏盐藻。利用改进的SOEing法,将杜氏盐藻NR基因Pnr与报告基因EGFP cDNA融合,并与pEGM-7zf克隆载体连接,顺序将盐藻NR基因Tnr序列与融合片段相连,构建含Pnr-EGFP-Tnr表达盒的盐藻真核表达载体p7NET。电击法转化杜氏盐藻,在盐藻转化株中观察到了EGFP的瞬时表达。此研究为转基因杜氏盐藻研究和成功建立杜氏盐藻生物反应器奠定了实验基础。     

《植物学通报》2006年 第23卷 总目次

第1期(2006年1月)1水稻突变体与功能基因组学郭龙彪储成才钱前14大豆胞囊线虫抗性基因定位与克隆研究进展袁翠平常汝镇邱丽娟23香石竹植株再生及基因工程研究进展余义勋刘娟旭包满珠29盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶基因克隆及其蛋白质结构预测李钢邓运涛任刚杨滔王小行37南美蟛蜞菊花的生长发育陈笛刘家亮孟祥春王小菁44欧美杂种山杨体细胞无性系变异的分析詹亚光齐凤慧高瑞馨杨传平52盐地碱蓬幼嫩花序的组织培养及植株再生赵术珍阮圆王宝山56PP333与BA组合对怀地黄试管苗生长发育的影响李明军徐鑫夏民张晓丽柳俊谢从华60植物春化作用的分子…     

培养液NaCl浓度对杜氏盐藻3-磷酸甘油脱氢酶同工酶的影响

目的：探讨在不同NaCl浓度下,杜氏盐藻（Dunaliella salina）的3-磷酸甘油脱氢酶（Glycerol 3-phosphate dehydrogen-ase,GPDH）同工酶的活性与其渗透调节相关性。方法：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）技术对在不同NaCl浓度生长的杜氏盐藻的GPDH进行同工酶电泳检测。结果：在0.5mol/LNaCl低盐的条件下,杜氏盐藻具有4种NAD＋-GPDH同工酶,分别为GPDH1、GPDH2、GPDH3、GPDH4。当NaCl逐渐分别增高为2.0、3.0、4.0、5.0mol/L时,只有1种NAD＋-GPDH同工酶即GPDH1。结论：GPDH1具有较高活性,这与高盐胁迫时细胞大量合成甘油进行渗透调节密切相关。     

不同品系杜氏藻的多相特征研究

杜氏藻(Dunaliella)是一类独特的嗜盐单细胞真核微藻, 为对该藻不同地理来源各品系间的特征进行总结及分类鉴定, 挖掘特色品系, 研究搜集国内外20株不同品系的杜氏藻, 利用PCR扩增内部转录间隔区(ITS)和细胞色素C氧化酶(cox2-3)基因, 生物信息学软件构建系统发育树对其进行分子鉴定; 形态学方法对其显微结构进行观察, 利用生理生化研究方法对杜氏藻盐胁迫下的4个代表性指标(最大光合效率、中性脂含量、β-胡萝卜素含量和3-磷酸甘油磷酸酶活性)进行了测定。结果表明, 20株供试藻均属杜氏藻属, ITS和cox2-3的系统发育结果相似, 均聚为两大簇, 各品系间亲缘关系较为接近; 成熟期的D13细胞最大, D14细胞最小并呈长颈形, 颜色以绿色或黄绿色为主, 鞭毛和眼点各异; D6和D10生长周期短, D18耐盐性最强; D7最大光合效率最高, D6和D18中性脂干重最高, D11的β-胡萝卜含量最高, D7的3-磷酸甘油磷酸酶活性最强。研究结果可为国内外杜氏藻资源的分类鉴定、特色资源的保护、开发与利用奠定基础。     

杜氏盐藻寡糖基转移酶亚基STT3a功能结构域的克隆与表达分析

为了研究STT3a基因在杜氏盐藻耐盐及鞭毛再生方面的作用,根据衣藻、拟南芥等STT3a蛋白的氨基酸高度保守序列VCVFTA、DVDYVL设计一对简并引物,采用RT-PCR及3'RACE的方法扩增杜氏盐藻STT3a蛋白功能结构域的cDNA序列。序列分析显示克隆的cDNA全长1650bp,具有一定保守性,与衣藻、拟南芥和人的相似性分别为48%、50%和46%。实时荧光定量PCR结果显示杜氏盐藻STT3amRNA水平随着盐浓度的升高而逐渐增加,其水平在3.5mol/LNaCl浓度时比在1.5mol/LNaCl浓度时升高了11倍(P0.01)。另外,与没有脱鞭毛的杜氏盐藻相比,STT3amRNA在鞭毛再生过程中持续高表达。本研究显示杜氏盐藻STT3a基因的高表达可以增强其盐适应和鞭毛再生能力。     

杜氏盐藻GAPDH cDNA的克隆鉴定及其启动子功能表达载体的构建

根据藻类甘油醛3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)氨基酸高度保守序列设计简并引物,采用5',3'-RACE和巢式PCR的方法,得到了杜氏盐藻(Dunaliella salina)GAPDH cDNA全长序列.序列同源性比较和进化树等生物信息学分析结果表明,根据获得的盐藻GAPDH的核酸序列推导的氨基酸序列与其他已知物种的GAPDH有较高的同源性.定向克隆于原核表达载体的盐藻GAPDH cDNA在大肠杆菌中以融合蛋白的形式得到了高效表达,并成功构建了由盐藻GAPDH基因启动子驱动的cat(氯霉素乙酰转移酶)基因表达载体pUCGCat,为进一步研究杜氏盐藻GAPDH基因和启动子功能奠定了试验基础.     

杜氏盐藻两种碳酸酐酶基因启动子的克隆和功能研究

将克隆得到的杜氏盐藻DCA7和CA基因的启动子区与bar基因和NOS polyA终止子片段融合,分别构建成pMDDC-B和pMDC-B转基因杜氏盐藻表达载体。用基因枪法将两种表达载体转化人杜氏盐藻细胞,通过除草剂草丁膦筛选培养获得转化藻株,对转化藻株进行分析。对转化杜氏盐藻藻株的筛选培养结果表明：pMDDC-B和pMDC-B载体中的外源bar基因能在杜氏盐藻细胞中稳定或瞬时表达。同时在氦气压力为690kPa条件下,微弹轰击2次比微弹轰击1次或3次的效果更好。对pMDDC-B转化杜氏盐藻得到的稳定表达的转化藻株进行的PCR和Southern印迹分析的结果表明：外源的bar基因确已整合到杜氏盐藻基因组中。Northern印迹分析表明：DCA7基因启动子驱动bar基因在杜氏盐藻细胞中的表达效率受氯化钠浓度梯度调控。推测首次克隆得到的DCA7基因启动子可能是一种活性高、安全性好的高渗诱导性启动子;杜氏盐藻DCA7和CA基因启动子区的GT高度重复序列,可能与杜氏盐藻高度耐盐的分子机制有关。     

杜氏盐藻分子生物学最新进展及展望

杜氏盐藻是一种无细胞壁的单细胞双鞭毛真核藻类,是一种十分重要的藻类资源。过去对杜氏盐藻的研究多集中在形态学、耐盐机理及β-胡萝卜素等方面,近年来,随着藻类基因工程的快速发展,本研究课题组及国内外在杜藻盐藻分子生物学方面做了大量工作,现就杜氏盐藻在这一领域的研究进展进行综述,主要是重要功能基因的克隆与分析、杜氏盐藻调控序列的研究以及杜氏盐藻作为宿主表达外源基因等。     

杜氏盐藻光系统Ⅰ反应中心psaB基因cDNA克隆及系统进化分析

杜氏盐藻是一种抗逆性很强的单细胞真核绿藻,能在010525mol/L 的盐水中生长,繁殖1。杜氏盐藻的突出优点在于培养条件简单,光合自养,抗逆性极佳,这些特性为利用其进行实验提供了便利。本研究通过比较现有已知物种的psaB 基因的氨基酸序列,利用 psaB 基因的氨基酸高度保守序列设计一对简并引物,采用 RT2PCR 从杜氏盐藻中克隆了psaB cDNA 片段,为进一步研究杜氏盐藻A2 亚基的结构与功能以及它的光合机理打下基础,同时通过 psaB 基因的进化分析可以更加深刻地了解杜氏盐藻与其他高等植物以及真核藻类之间的亲缘关系.       

杜氏盐藻外源基因稳定表达系统的构建

建立了一种单细胞海水绿藻--杜氏盐藻(Dunaliella salina Teod.)的外源基因稳定表达系统.通过电激法将携带乙肝病毒表面抗原基因(HBsAg)和氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)的质粒转入盐藻细胞内,CAT基因为筛选基因.PCR和Southern杂交结果显示,HBsAg基因已经整合到盐藻基因组中.Northern杂交结果表明,转化成功细胞内的该基因已转录成mRNA.HBsAgELISA和Western杂交检测证明,HBsAg蛋白在转化的盐藻细胞内稳定地表达.同时,PCR和Southern杂交显示,CAT基因也已整合到盐藻基因组中.且CATELISA检测证明,CAT蛋白在转化体中也已稳定地表达.进一步对转化盐藻进行无氯霉素筛选培养,60代后,HBsAg基因依然稳定地存在并表达.本实验第一次报道了外源基因在杜氏盐藻细胞内的稳定表达.     

Cloning and characterization of a plastidic glycerol 3-phosphate dehydrogenase cDNA from Dunaliella salina

A cDNA encoding a nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) -dependent glycerol 3-phosphate dehydrogenase (GPDH) has been cloned by rapid amplification of cDNA ends from Dunaliella salina. The cDNA is 3032 base pairs long with an open reading frame encoding a polypeptide of 701 amino acids. The polypeptide shows high homology with published NAD+ -dependent GPDHs and has at its N-terminal a chloroplast targeting sequence. RNA gel blot analysis was performed to study GPDH gene expression under different conditions, and changes of the glycerol content were monitored. The results indicate that the cDNA may encode an osmoregulated isoform primarily involved in glycerol synthesis. The 701-amino-acid polypeptide is about 300 amino acids longer than previously reported plant NAD+ -dependent GPDHs. This 300-amino-acid fragment has a phosphoserine phosphatase domain. We suggest that the phosphoserine phosphatase domain functions as glycerol 3-phosphatase and that, consequently, NAD+ -dependent GPDH from D. salina can catalyze the step from dihydroxyacetone phosphate to glycerol directly. This is unique and a possible explanation for the fast glycerol synthesis found in D. salina.     

杜氏盐藻外源基因稳定表达系统的构建(英文)

A stable transformation system for the expression of foreign genes in the unicellular greenmarine alga (Dunaliella salina Teod.) was established. Using electroporation, the alga was transformed witha plasmid containing the hepatitis B surface antigen (HBsAg） gene and the chloramphenicol acetyltransferase(CAT) gene as a selectable gene. PCR and Southern blotting analysis indicated that the HBsAEgene wasintegrated into the D. salina genome. Northern dotting analysis showed that the HBsAg gene was expressedat the mRNA level. The stable expression of HBsAg protein in transformants was confirmed by HBsAgenzyme-linked immunosorbent assay (HBsAg EUSA) and Western blotting analysis. Also, PCR and Southernblotting analyses showed that the CA Tgene was integrated into the D, salina genome, and CAT EUSAindicated that CAT protein was stably expressed in the cells. The introduced HBsAg DNA and HBsAgprotein expression were stably maintained for at least 60 generations in media devoid of chloramphenicol.This is the first report of the stable expression of foreign genes in D. salina.     

人canstatin基因转化新型生物反应器－杜氏盐藻(Dunaliella salina)的初步研究

本文采用RT-PCR技术从人的胎盘组织中克隆canstatin基因,定向连接到表达载体pUΩ上,然后与筛选标记bar盒连接得到真核表达载体pUΩ-Can-Bar。采用玻璃珠转化法将该表达载体转化杜氏盐藻（以下简称盐藻）,通过草丁膦固体平板筛选得到转化株,进而对转化株进行阳性鉴定。PCR结果显示,在盐藻转化株中均能够扩增出约700 bp特异的条带,而在阴性对照中没有扩增出该条带。Southern blot结果进一步证明人canstatin基因已经整合到盐藻细胞的基因组中。此外,本文对盐藻转化株的遗传稳定行进行了分析,结果表明canstatin基因能够在转化藻株中稳定遗传。人canstatin转基因盐藻株的成功制备为利用盐藻反应器大规模生产人canstatin蛋白提供了实验依据,为及早实现canstatin蛋白在治疗肿瘤上的临床应用提供了前期工作基础。     

Identification of a gene encoding the light-harvesting chlorophyll a/b proteins of photosystem I in green alga Dunaliella salina.

There are four LhcII genes of Dunaliella salina have been submitted to the database of GenBank. However, little is known about Lhca genes of this green alga, although this knowledge might be available to study the composition and phylogenesis of Lhc gene family. Recently, one Lhca gene was been cloned from the green alga D. salina by PCR amplification using degenerate primers. This cDNA, designated as DsLhca1, contains an open reading frame encoded a protein of 222 amino acids with a calculated molecular mass of 27.8 kDa. DsLhca1 is predicted to contain three transmembrane domains and a N-terminal chloroplast transit peptide (cTP) with length of 33 amino acids. The genomic sequence of DsLhca1 is composed of five introns. The deduced polypeptide sequence of this gene showed a lower degree of identity (less than 30%) with LHCII proteins from D. salina. But its homology to Lhca proteins of other algae (Volvox carteri Lhca_AF110786) was higher with pairwise identities of up to 67.1%. Phylogenetic analysis indicated that DsLhcal protein cannot be assigned to any types of Lhca proteins in higher plants or in Chlamydomonas reinhardtii.     

通过cDNARDA法分离和识别盐藻(Dunaliella salina)盐胁迫相关基因

采用cDNA代表性差异分析 (RDA)技术 ,对盐藻在盐胁迫时差异表达的基因进行了分离鉴定 .在分离到的 10个基因中 ,有 5个与已知基因同源 (包括叶绿素a b结合蛋白基因、蛋白磷酸酶I催化亚基基因和 3个核糖体蛋白基因 ) ,还有 5个未知功能基因则是首次在盐藻中被分离 .值得注意的是 ,所有这 5个已知基因的功能都与细胞分裂或盐胁迫有关 .结果表明 :取样时盐藻细胞仍处于恢复阶段 ,所分离到的基因对于盐藻耐盐可能具有重要意义 ;蛋白磷酸酶I的下调表达可能是盐藻调节离子平衡的一个重要过程和细胞分裂受阻的原因所在 ;盐藻减缓细胞分裂速度可能是为了减少能量消耗 ,以留出足够的能量来应对盐胁迫 ;其它 5个未知基因可能也与盐藻适应盐胁迫机制有关 .     

盐藻线粒体GIY-YIG族归巢内切酶基因受到盐胁迫时增强转录

盐藻 (Dunaliellasalina (Chlorophyta) )极强的耐盐能力使之成为研究植物耐盐分子机制的重要模式生物 .在前期分离到的一个盐藻基因片段在盐胁迫时增强表达的基础上 ,通过RACE获得了该基因 5′端cDNA序列及部分 3′端cDNA序列 .序列分析结果表明 ,该基因是一个编码线粒体GIY YIG族归巢内切酶的Ⅰ型内含子基因 .RNase freeDNase处理及Northern杂交结果表明 ,盐藻线粒体DNA在盐处理组中可能发生了扩增 .这些结果结合前人的研究成果说明 ,该内含子基因的增强表达可能并非盐藻对抗盐胁迫的一种手段 ,而是盐藻对抗盐胁迫的副产品 .被该内含子基因插入的基因是盐藻对抗盐胁迫所需要增强表达的 .线粒体DNA的扩增可能是细胞在受到盐胁迫时线粒体数量增加的结果     

Cloning, expression, and functional characterization of the Dunaliella salina 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene in Escherichia coli

5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSP synthase, EC 2.5.1.19) is the sixth enzyme in the shikimate pathway which is essential for the synthesis of aromatic amino acids and many secondary metabolites. The enzyme is widely involved in glyphosate tolerant transgenic plants because it is the primary target of the nonselective herbicide glyphosate. In this study, the Dunaliella salina EPSP synthase gene was cloned by RT-PCR approach. It contains an open reading frame encoding a protein of 514 amino acids with a calculated molecular weight of 54.6 KDa. The derived amino acid sequence showed high homology with other EPSP synthases. The Dunaliella salina EPSP synthase gene was expressed in Escherichia coli and the recombinant EPSP synthase were identified by functional complementation assay.