细胞基质Ⅰ型胶原通过调控β-catenin促进头颈鳞癌细胞转移和增殖

为探讨细胞基质Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)对头颈鳞癌细胞转移和增殖能力的影响,以头颈鳞癌细胞株为对象,运用transwell小室检查细胞的体外迁移能力,用倒置显微镜成像系统检测细胞的运动速度和扩散能力,Western blotting或/和免疫细胞荧光染色检测细胞表面黏附分子E-cadherin的表达和β-catenin的细胞定位,采用MTT以及PCNA的表达水平评价细胞增殖.结果显示,Col-Ⅰ能够促进头颈鳞癌细胞迁移、提高细胞运动速度、加快细胞扩散,其可能机制是通过上调β-连环蛋白磷酸化,从而下调黏附蛋白E-cadherin的表达.Col-Ⅰ还能促进头颈鳞癌细胞的增殖,其可能机制是增加β-catenin的核移位,提高细胞周期蛋白D1(cyclin D1)表达.研究结果表明,Col-Ⅰ通过上调β-catenin磷酸化水平,以及促进β-catenin核移位,从而增强头颈鳞癌细胞的转移和增殖能力.     

siRNA对肝纤维化的抑制作用

目的:研究肝星状细胞(HSC)中smad2特异性小干扰RNA(siRNA)对Ⅰ型胶原表达的抑制作用,探讨抗肝纤维化的基因治疗新方法。方法:设计合成靶向Smad2基因的siRNA,将筛选成功的siRNA瞬时转染入体外培养的肝星状细胞(HSC),并给予转化生长因子β(TGF-β)刺激,应用RT-PCR和Western blot技术检测对照组与实验组Ⅰ型胶原mRNA水平和蛋白水平表达差异,研究siRNA对Ⅰ型胶原表达的抑制作用。结果:siRNA能明显降低肝星状细胞中Smad2的RNA和蛋白的表达水平,证实筛选的siRNA有效,能特异性抑制Smad2的基因表达;TGF-β刺激肝星状细胞后,与对照组比较,siRNA转染组细胞外基质(ECM)成分Ⅰ型胶原的表达水平明显降低(P<0.05)。结论:siRNA能够抑制TGFβ对肝星状细胞的激活,阻断TGFβ-Smads传导通路,使Ⅰ型胶原分泌下调,有效抑制TGFβ诱导的肝纤维化。     

HOXA5对病理性瘢痕成纤维细胞功能的调控机制研究

该课题旨在研究HOXA5对病理性瘢痕成纤维细胞凋亡和细胞行为的影响,以及HOXA5对细胞内p53通路活化的调控作用。取患者增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织,分离培养成纤维细胞。将HOXA5过表达质粒转染细胞,通过CCK-8检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况, Transwell检测细胞迁移能力, Western blot检测细胞内α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、黏着斑蛋白(vinculin)以及I、III型前胶原肽的蛋白含量,并构建含成纤维细胞的胶原网架(FPCL)评价细胞收缩能力。进一步通过p53启动子荧光素酶报告基因检测HOXA5对p53通路的激活作用, ChIP PCR检测HOXA5与p53启动子区含ATTA的HOX核心结合序列的结合情况。Western blot检测p53下游靶点p21和MDm2蛋白含量。结果显示,转染了HOXA5过表达质粒的细胞增殖活性下降,迁移、收缩能力减弱,细胞凋亡情况加重,细胞内α-SMA、vinculin以及I、III型前胶原肽的蛋白含量减少。细胞内进一步的机制研究发现, HOXA5过表达可以促进p53启动子荧光素酶报告基因的表达, ChIP PCR检测发现,过表达HOXA5后, p53启动子区富含ATTA的HOX核心结合序列区域结合的HOXA5增多,并且p53下游靶点p21和MDm2蛋白含量显著增加。综上,该实验证实了HOXA5可以激活病理性瘢痕成纤维细胞内p53凋亡通路,并促进细胞凋亡,抑制细胞的增殖、迁移和收缩能力。     

短间隔连续部分肝切除与细胞增殖相关的TNF－α、c－myc、p53、p21、PCNA、Bcl－2、TGF－β的变化分析

为了阐明短间隔连续部分肝切除模型（SISPH）（0-4-40-76-112h)中各时段与细胞增殖的关系。本文利用Western blot技术,分别检测短间隔连续部分肝切除模型（0-4-40-76-112h)中各时段TNF-α,c-myc,p53,p21,PCNA,Bcl-2,TGF-β在体外的表达情况。结果显示：SISPH4h时,TNF-α和c-myc表达量最高,p53和PCNA表达量无明显变化;SISPH40h和76h时,p53和PCNA的表达量达到峰值,Bcl-2上调表达;SISPH112h,p53,PCNA,TGF-β表达量较对照高,Bcl-2表达较低,因此,SISPH4h时细胞由G0期进入G1期;SISPH40h和76h时细胞分裂旺盛;SISPH112h时,细胞仍然增殖,但不及40和76h旺盛,细胞凋亡增高,可能与肝组织结构重建和功能调整有关。     

Notch3对促进胰腺星形细胞活化的基因表达及信号通路的影响

目的: 分离培养小鼠胰腺星形细胞(PSCs),检测Notch3 对促进PSCs活化的基因表达及信号通路的影响。方法: 对小鼠PSCs进行分离培养及传代。采用免疫荧光染色检测活化的小鼠PSCs中α-SMA, fibronectin及collagen I的表达;细胞分组为空白对照组(MOCK组),阴性对照组(转染Notch3 siRNA negative control,NC组),Notch3 siRNA组(转染Notch3 siRNA,N3 siRNA组)及Notch3 siRNA-1组(转染Notch3 siRNA-1,N3 siRNA-1组),提取各组总RNA,测定RNA浓度及纯度后,送至安诺优达基因科技(北京)有限公司进行转录组测序。结果: 免疫荧光结果显示,在活化的PSCs中α-SMA,fibronectin及collagen I都有明显的表达。测序结果分析表明,与NC组相比较,在N3 siRNA组与N3 siRNA-1组,α-SMA基因,collagen I基因,fibronectin基因及CTGF基因均表达下调,与胶原蛋白代谢过程相关的基因表达上调,正向调节胶原生物合成的基因表达下调,而负向调节胶原生物合成的基因表达上调,PCNA基因表达下调;在N3siRNA组与N3siRNA-1组,调节细胞聚集的基因表达下调;在细胞组分部分,细胞外基质的基因表达下调;抑制PSCs中Notch3的表达可对细胞粘附分子信号通路,MAPK信号通路及TGF-β信号通路的组成成员的基因表达产生影响。结论: 抑制Notch3的表达可抑制PSCs的活化,降低细胞增殖能力,降低迁移聚集能力及ECM合成的能力;抑制Notch3的表达可对其他的信号如细胞粘附分子信号通路,MAPK信号通路及TGF-β信号通路产生影响。     

siRNA对肝纤维化的抑制作用

目的：研究肝星状细胞（use）中smad2特异性小干扰RNA（siRNA）对I型胶原表达的抑制作用,探讨抗肝纤维化的基因治疗新方法。方法：设计合成靶向Smad2基因的siRNA,将筛选成功的siRNA瞬时转染入体外培养的肝星状细胞（HSC）,并给予转化生长因子p（TGF．B）刺激,应用RT—PCR和Westernblot技术检测对照组与实验组I型胶原mRNA水平和蛋白水平表达差异,研究siRNA对I型胶原表达的抑制作用。结果：siRNA能明显降低肝星状细胞中Smad2的RNA和蛋白的表达水平,证实筛选的siRNA有效,能特异性抑制Smad2的基因表达;TGF-β刺激肝星状细胞后,与对照组比较,siRNA转染组细胞外基质（ECM）成分I型胶原的表达水平明显降低（P〈0．05）。结论：siRNA能够抑制TGFβ对肝星状细胞的激活,阻断TGFB—Smads传导通路,使I型胶原分泌下调,有效抑制TGFB诱导的肝纤维化。     

去铁酮对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响

去铁酮可诱导p53的表达和引发肿瘤细胞凋亡。RRM2B基因在铁螯合剂抑制肿瘤细胞生长中同样起重要作用,且其表达受p53调节。为了探讨去铁酮对宫颈癌细胞的影响,以及p53和RRM2B基因二者的关系,通过MTT法检测不同浓度及不同时间去铁酮处理对HeLa细胞活性的影响,采用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。同时,利用Western-blot和荧光定量PCR技术分别在蛋白和mRNA水平检测p53和RRM2B表达变化,并进一步利用p53抑制剂检测p53对RRM2B表达的影响。结果表明,HeLa细胞活性随着去铁酮作用浓度及作用时间的增加而下降,在500μmol/L去铁酮处理48h后出现明显凋亡。进一步研究发现,去铁酮可显著上调p53表达水平(P0.05),而p53可显著下调RRM2B表达水平(P0.05)。综上所述,去铁酮可通过p53下调RRM2B表达水平而参与抑制宫颈癌细胞增殖。     

肺癌组织中PCNA、p63和p53蛋白的表达及临床意义

目的:检测蛋白增殖细胞核抗原(PCNA)、p63和p53在肺癌组织中的表达情况,以探讨三者在肺癌的发生、发展中的生物学作用和临床意义。方法:选取195例肺癌组织(其中57例有癌旁组织),应用组织芯片技术和免疫组织化学方法观察三种蛋白的表达情况,并研究三者之间及其与临床病理参数的关系。结果:PCNA、p63和p53蛋白在肺癌组织中的阳性表达率分别为96.41%、38.46%及58.46%,但三者在癌旁组织中均无表达,差异有统计学意义(均P0.05);在肺癌组织中,PCNA、p63和p53蛋白的表达情况均与组织分型有关(P0.05),且PCNA、p53蛋白表达与分化程度有关(P0.05),分化越差,表达越高;p53表达与PCNA表达呈正相关(r=0.352,P=0.043),p63与p53、PCNA的表达不相关(P0.05)。结论:肺癌组织中PCNA、p63和p53蛋白的表达升高,三者均在肺癌的发生、发展中发挥着重要作用,并且临床可通过检测三者的蛋白水平,作为鉴别肺鳞状细胞癌与其他类型癌的重要参考指标,为病理诊断提供依据。     

逆转病毒介导的突变型p53基因增加人肺癌细胞耐药性研究

应用PCR等方法从含有p53基因突变的人肺癌细胞系GL总RNA中扩增并克隆了人突变型p53基因(mt)cDNA.序列分析证实该cDNA含有人p53基因全部编码序列,在codon245出现了G→T突变,导致由甘氨酸变为半胱氨酸.构建了其逆转病毒表达载体(pD53M),并将该载体导入没有p53突变的药物敏感癌细胞系GAO.免疫组织化学证实pD53M转染的GAO细胞有突变型p53蛋白表达,说明重组逆转病毒表达载体pD53M在GAO细胞中可以稳定表达.体内和体外实验表明pD53M转染的GAO细胞对几种抗癌药的耐药性有不同程度的增加,最高增加了4倍.用定量PCR和FCM分析发现转染细胞MDR1基因表达没有增高,Pgp功能没有加强,MRP基因表达轻度增高,Mrp功能稍微加强,这提示突变型p53导致的耐药性可能与MDR1/Pgp无关,而与MRP/Mrp可能有一定关系.