厌氧颗粒污泥微生物总DNA的提取

目的:为了从分子水平上了解厌氧颗粒污泥中微生物的种类和数量,研究一种高效提取环境微生物DNA的方法。方法:厌氧颗粒污泥样品经液氮速冻、沸水浴融化、溶菌酶处理和SDS裂解后,琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA,以提取的总DNA为模板,进行细菌核糖体小亚基16S rDNA基因V8、V9区的PCR扩增。结果:经检测,其DNA片段约为20 kb,样品D260nm/D280nm值为1.88,扩增结果理想,与OMEGA公司提供的试剂盒提取效果基本一致。结论:为薯类酒糟厌氧发酵污泥中微生物群落的分子生态学研究提供了一种简便、可靠的DNA提取方法。     

一种从鱼类肌肉组织中提取基因组DNA的简易方法

以泰山螭霖鱼、黄河鲤鱼、东平湖鲫鱼为材料,采用改进的酚-氯仿抽提法和蛋白酶K消化法提取基因组DNA,并对其进行紫外分光光度、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、微卫星PCR扩增等方法的鉴定。结果表明,本方法提取的鱼类基因组DNA浓度为0．9-3．25μg／μL,D260nm/D280nm值为1．79-1．87,电泳条带整齐明亮,适合微卫星PCR扩增。因此,本方法能够从鱼类肌肉组织中获得较为纯净的基因组DNA,适于进一步的分子生物学研究之用。     

活性污泥总DNA提取方法的研究

采用冻融＋玻璃珠、溶菌酶＋SDS和冻融＋玻璃珠＋溶菌酶＋SDS的方法提取活性污泥的微生物总DNA,并对以上三种方法进行比较,从中确定最佳的方法,以实现普通实验条件下成功提取符合PCR扩增要求的DNA。经紫外光度分析及电泳结果表明,冻融＋玻璃珠＋溶菌酶＋SDS方法所得的DNA的OD260/OD280为1．81,电泳结果显示,所提DNA片段分子量大于10kb,适于酶解和PCR扩增要求,为PCR技术应用于活性污泥的研究提供了一种简便、可靠的DNA提取方法。     

向日葵种子不同部位微量提取DNA用于PCR的研究

探索了从向日葵成熟种子的单粒种子、1/2种子、1/4种子、1/8种子中提取DNA的方法,结果表明,无论是从单粒种子、1/2种子、1/4种子还是1/8种子都能提取质量较好的DNA,对所有提取的DNA,进行RAPD分析,都能得到扩增产物,1/8种子提取的DNA量可保证用于2次PCR扩增。从种子的不同部位提取的DNA与从幼苗中提取的DNA用于RAPD分析,所得结果一致。说明直接从微量向日葵种子提取DNA应用于分子检测是可行的,但直接从向日葵果皮中提取DNA的技术有待进一步研究。     

从土壤中提取DNA用于PCR扩增

设计、比较了5种直接从土壤中提取DNA的方法。实验结果表明这5种方法都可以从土壤中提取到长度大于15kb的DNA片段,但在不同方法间DNA的产量存在很大差异;初提的土壤DNA经进一步提纯后均可用于PCR反应,利用细菌16S rRNA基因和抗菌肽Shiva-1基因的引物都得到了相应的目的产物。其中方法5提取DNA产量最高,无明显降解,且重复性好,是一种从小量土壤样品中直接提取DNA的理想方法。     

几种松科植物基因组总DNA的提取

采用CTAB法和蛋白酶K法．提取校园内几种松科植物新梢、种子及幼叶的总DNA,经琼脂糖凝胶电泳检测,无降解发生。利用PCR—SSCP初步分析了这几种针叶树的叶绿体matK基因,结果表明：提取的总DNA可以进行PCR—SSCP分析。     

马蹄金基因组DNA的提取方法比较

对马蹄金基因组DNA的提取方法———快速提取法、小量提取法和大量提取法进行了对比分析,结果表明,利用快速提取法可在20 min内快速可靠地从马蹄金(Dichondra repensForst.)组织中提取DNA,与小量提取法和大量提取法获得的DNA用于PCR检测结果一致,可为转基因植物的快速检测提供方法。     

Chelex-100法及酚氯仿法提取阴道毛滴虫DNA的比较

目的-比较Chelex-100法和酚氯仿法提取阴道毛滴虫基因组DNA。方法-分别用Chelex-100法和酚氯仿法提取阴道毛滴虫基因组DNA,用PCR法检测DNA提取的有效性。结果两种方法提取的DNA经PCR扩增均有特定的条带。结论-两种方法均能提取阴道毛滴虫DNA。Chelex-100方法简便、省时,较适用于分子生物学研究及临床PCR扩增使用。     

利用CTAB法和子囊孢子破壁法提取冬虫夏草菌DNA

通过CTAB法从冬虫夏草菌株和天然冬虫夏草不同部位提取DNA,并用PCR扩增进行验证,证明了CTAB法适合从冬虫夏草子座、菌核和冬虫夏草菌培养物中提取DNA。首次报道1种将子囊孢子破壁直接进行PCR扩增的方法,并比较了该方法和CTAB法在提取冬虫夏草DNA方面的差异。2种方法获得的DNA用于PCR扩增均能得到较好的结果。     

从土壤中提取DNA用于PCR扩增*

设计、比较了5种直接从土壤中提取DNA的方法。实验结果表明这5种方法都可以从土壤中提取到长度大于15kb的DNA片段,但在不同方法间DNA的产量存在很大差异;初提的土壤DNA经进一步提纯后均可用于PCR反应,利用细菌16S rRNA基因和抗菌肽Shiva-1基因的引物都得到了相应的目的产物。其中方法5提取DNA产量最高,无明显降解,且重复性好,是一种从小量土壤样品中直接提取DNA的理想方法。     

核酸层析法转基因快速检测体系的建立及应用

随着我国转基因研究及产业化进程提速,转基因检测的重要性日益凸显,因而快速、高效的分子检测新方法的研发具有重要的生产实践及科研意义。在转基因检测中,常规PCR技术具有检测范围广的特点,但较为费时费力,且对实验条件要求较高;而胶体金蛋白试纸法检测方便、快捷,但可检范围窄。基于此,建立了一套基于核酸层析法快速转基因检测的方法体系。将经液氨研磨后的样品通过一管法提取DNA后直接进行PCR扩增,再将PCR扩增产物滴加到胶体金检测卡上,通过直接观察胶体金卡条显色状况进行结果判别。此方法最终检验出玉米内参基因ZSSⅡB及Zein、大豆内参基因SPS、水稻内参基因Lectin,转基因元件启动子CaMV35S及终止子NOS,以及抗虫基因Cry1Ab/1Ac、抗除草剂基因Bar、Pat、CP4-EPSPS及选择标记基因NPTⅡ、Pmi等外源基因;并成功检出特异性转基因事件Mir604及Bt11。研究获得的核酸层析检测方法具有灵敏度高、省时省力且对检测条件要求低等优点,集PCR法与蛋白试纸检测法二者优势于一身,可广泛应用于转基因产品的精确快速检测,为我国转基因生物安全监管提供了良好的技术支撑。     

一种适于PCR检测的DNA微量提取方法

报道一种简单快速、适于转基因再生植株鉴定的DNA微量提取方法。此法特点:无须研磨,不用液氮,取样量少,操作简便,可在一个离心管中完成;较短时间内可检测大量再生植株,所提取的DNA样品可满足PCR检测要求,结果稳定。     

转水稻粗缩病毒运动蛋白缺陷型基因玉米的二重PCR检测研究

本研究以外源基因（RDV MP-）和玉米内源基因Zein作为PCR扩增对象,旨在建立一种简便有效的转基因玉米及其产品的二重PCR检测技术。转外源基因（RDV MP-）材料的常规PCR检测结果证明外源基因在转基因材料中可稳定遗传;对常规PCR检测的阴性结果材料进行二重PCR检测,扩增结果除进一步证实常规PCR检测的阴性结果结论外,还证明提取的植物总DNA质量符合试验要求,进而从二重PCR检测结果还得出常规PCR检测的阴性结果出错率为1.4%。此方法简单,实用,结果可靠,可适用于转基因植物及产品的检测。     

Rapid identification of transformed wheat using a half-seed PCR assay

A simple, nondestructive PCR-based screening method has been developed for identifying putative transgenic soft white winter wheat (Triticum aestivum L.) carrying the coat protein gene of wheat streak mosaic virus. Removal of the endosperm end of individual seed provided sufficient material for DNA extraction and PCR. DNA from seed is more free of the secondary, metabolites found in leaf tissue that can inhibit both PCR and restriction digests required for Southern analysis. The half-seed PCR assay has comparable accuracy to the leaf-tissue PCR assay and hence can be used as an accurate and rapid method for identifying transformed lines before planting. Germination of the remaining seed portion showed germination rates comparable to whole-seed controls. A slight delay in growth from the first-leaf through the first-tiller stage was observed in the half-seed-derived plants, as compared to plants grown from whole seed.     

一种转基因植物高特异定性检测方法

近年来,植物基因工程技术的迅速发展使得转基因植物及其产品与人们生活越来越密切.与此同时,转基因植物检测技术不断丰富和发展,主要是在整合、转录、翻译等不同水平上检测转基因产物的存在.但各种方法都存在不同的缺点,如缺乏特异性、假阳性较高,操作繁琐、成本高等.利用TAIL-PCR(thermal asym-metric interlaced PCR)和融合克隆结合建立一种简单、快速、特异性高的转基因植物检测方法,以两个转基因植株(C3-3株系和TB-5株系)为例,通过TAIL-PCR获得其侧翼序列后设计特异引物,并用于特定转基因植株的筛选.     

PCR-Free Detection of Genetically Modified Organisms Using Magnetic Capture Technology and Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy

The safety of genetically modified organisms (GMOs) has attracted much attention recently. Polymerase chain reaction (PCR) amplification is a common method used in the identification of GMOs. However, a major disadvantage of PCR is the potential amplification of non-target DNA, causing false-positive identification. Thus, there remains a need for a simple, reliable and ultrasensitive method to identify and quantify GMO in crops. This report is to introduce a magnetic bead-based PCR-free method for rapid detection of GMOs using dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS). The cauliflower mosaic virus 35S (CaMV35S) promoter commonly used in transgenic products was targeted. CaMV35S target was captured by a biotin-labeled nucleic acid probe and then purified using streptavidin-coated magnetic beads through biotin-streptavidin linkage. The purified target DNA fragment was hybridized with two nucleic acid probes labeled respectively by Rhodamine Green and Cy5 dyes. Finally, FCCS was used to detect and quantify the target DNA fragment through simultaneously detecting the fluorescence emissions from the two dyes. In our study, GMOs in genetically engineered soybeans and tomatoes were detected, using the magnetic bead-based PCR-free FCCS method. A detection limit of 50 pM GMOs target was achieved and PCR-free detection of GMOs from 5 µg genomic DNA with magnetic capture technology was accomplished. Also, the accuracy of GMO determination by the FCCS method is verified by spectrophotometry at 260 nm using PCR amplified target DNA fragment from GM tomato. The new method is rapid and effective as demonstrated in our experiments and can be easily extended to high-throughput and automatic screening format. We believe that the new magnetic bead-assisted FCCS detection technique will be a useful tool for PCR-free GMOs identification and other specific nucleic acids.     

一种基于PCR技术鉴定单拷贝转基因烟草的方法

为了鉴定携带单拷贝外源基因的转基因烟草植株,以烟草核基因组上已知的单拷贝内源基因（RNR2）为内参,转基因烟草植株基因组DNA为模板,在同一PCR反应体系中扩增内源基因（RNR2）和外源目的基因（NPTⅡ）。反应产物在琼脂糖凝胶上电泳,获得了预期大小的两条特异性扩增条带。经ImageJ软件捕捉分析两条目的条带的灰度比,当T1代转基因烟草植株中外源基因与内源基因的扩增条带灰度比为1时,所检测植株即为单拷贝外源基因的转基因烟草植株。孟德尔经典遗传学方法证实了上述检测结果高度可信。     

深黄被孢霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因在转基因烟草中的表达

γ—亚麻酸(GLA)是人体和动物饮食中具有营养作用的重要的多烯不饱和脂肪酸,在大多数油料作物种子中不含有GLA,而只含有其前体物亚油酸,只有少数油料植物种子中含有GLA,如夜来香(Oenothera spp),琉璃苣(Borago officinalis)等。△^6—脂肪酸脱氢酶可将亚油酸转化为γ—亚麻酸,为了能够在传统的油料作物种子中产生GLA,我们将从深黄被孢霉中克隆的△^6—脂肪酸脱氢酶基因,与植物表达载体pGA643连接,构建了重组质粒pGAM—ICL6,将其通过农杆菌介导法,导入模式植物烟草中。经PCR和Southern杂交分析表明该基因已导入并整合到烟草的基因组中,Northern杂交结果表明该基因在转基因烟草的mRNA水平上获得表达。对转基因植株进行脂肪酸分析,结果显示,GLA和十八碳四烯酸(OTA)分别占总脂肪酸含量的19．7％和3．5％。     

Rapid and reliable extraction of genomic DNA from various wild-type and transgenic plants

Background  

DNA extraction methods for PCR-quality DNA from calluses and plants are not time efficient, since they require that the tissues be ground in liquid nitrogen, followed by precipitation of the DNA pellet in ethanol, washing and drying the pellet, etc. The need for a rapid and simple procedure is urgent, especially when hundreds of samples need to be analyzed. Here, we describe a simple and efficient method of isolating high-quality genomic DNA for PCR amplification and enzyme digestion from calluses, various wild-type and transgenic plants.