沙葱萤叶甲钙结合蛋白基因的鉴定及表达谱分析

【目的】沙葱萤叶甲Galeruca daurica是一种近年来在内蒙古草原上猖獗成灾的新害虫。本研究旨在克隆沙葱萤叶甲钙结合蛋白(calcium-binding protein, CaBP)基因,分析其在沙葱萤叶甲成虫不同发育阶段及不同温度下的表达谱,为进一步探究其在沙葱萤叶甲生长发育及滞育过程中的作用奠定基础。【方法】根据沙葱萤叶甲转录组和蛋白质组数据,筛选CaBP基因序列信息,应用RT-PCR技术克隆获得CaBP基因的开放阅读框(ORF)全长序列,并对其进行生物信息学分析;通过qPCR检测其在沙葱萤叶甲成虫不同日龄(羽化后3, 7, 10, 15, 20, 30, 40, 60, 90和110 d)及3日龄成虫在不同温度(0, 5, 10,15, 20, 25, 30和35℃)下处理1 h后的表达水平。【结果】克隆得到4条具有完整ORF的沙葱萤叶甲CaBP基因cDNA序列,分别命名为GdCaM, GdCAPSL, GdTnCl和GdCRT(GenBank登录号: MN695412-695415),ORF全长分别为480, 648, 516和1 209 bp,分别编码149, 215, 171和402个氨基酸;只有GdCRT拥有信号肽。同源序列比对和系统发育分析表明,GdCaM, GdCAPSL, GdTnCl和GdCRT分别与玉米根萤叶甲Diabroticavirgifera virgifera的CaM, CAPSL, TnCl及马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata CRT的氨基酸序列一致性最高,分别为100.0%, 74.0%, 88.2%和92.5%。qPCR结果表明,4个CaBP基因在沙葱萤叶甲不同日龄成虫中均差异表达,且表达模式不同。GdCaM在成虫滞育前(羽化后3 d)表达量较高,进入滞育后(羽化后7 d)表达量降低,在滞育期间(羽化后7-60 d)表达量变化较小,而解除滞育后(羽化后90 d)表达量进一步下调。GdCAPSL在滞育初期(羽化后10 d)维持在最低水平,进入滞育中后期(羽化后40和60 d)开始回升,滞育解除后又突然下调至最低水平,而羽化后110 d急剧上升至最高水平。GdTnCl在滞育初期(羽化后15-20 d)高表达,进入滞育中后期(羽化后30-60 d)急剧下降至最低水平,滞育解除后再次上调,但羽化后110 d突然下调至最低水平。GdCRT在进入滞育后表达量开始逐渐下调,在滞育维持期间(羽化后15-60 d)维持在低水平,滞育解除后又开始上升。温度对3日龄成虫中除GdCRT外的其他3个CaBP基因的表达有显著影响。温度低于20℃时,GdCaM的表达量随温度的降低而升高,但0℃时突然下降;温度高于20℃时,GdCaM的表达量随着温度的升高而上升。GdCAPSL的表达量随着温度的升高而呈现上升的趋势,25℃时达到最高,然后下降。GdTnCl随着温度的升高,表达量呈现下降的趋势。【结论】钙结合蛋白可能在沙葱萤叶甲成虫生长发育及夏滞育调控过程中发挥着重要作用。     

沙葱萤叶甲保幼激素结合蛋白基因GdJHBP的克隆及表达分析

【目的】克隆沙葱萤叶甲Galerucadaurica保幼激素结合蛋白基因(Juvenilehormonebinding protein,JHBP)cDNA全长序列,分析其分子特征和表达特性,为进一步明确其在沙葱萤叶甲生长发育及滞育中的作用奠定基础。【方法】基于本实验室组装的沙葱萤叶甲转录组数据库,采用RACE技术,克隆沙葱萤叶甲GdJHBP基因cDNA全长序列;运用ORF Finder、SignaIP、DNAMAN和TMHMM等软件分析其分子特征;利用MEGA6.0软件中的邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育树;应用荧光实时定量PCR(RT-qPCR)技术分析GdJHBP在沙葱萤叶甲不同发育时期、成虫不同组织及高温胁迫下的表达模式。【结果】克隆获得了沙葱萤叶甲保幼激素结合蛋白基因GdJHBP cDNA全长序列(GenBank登录号:MG460309),cDNA全长为826 bp,开放阅读框(ORF)为714 bp,编码237个氨基酸;蛋白质预测分子量为26.58ku,等电点为4.37;包含1条信号肽,无跨膜区,且在第27-189位氨基酸之间存在一个保幼激素结合蛋白家族JHBP保守结构域。序列比对分析表明,不同昆虫JHBP间氨基酸序列一致性较低,沙葱萤叶甲GdJHBP与棕榈象RhynchophorusferrugineusRfJHBP和马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata JHBP 3p2的氨基酸序列一致性最高也仅为30%。系统发育分析表明,GdJHBP与棕榈象血淋巴JHBP亲缘关系最近。RT-qPCR结果显示,GdJHBP在沙葱萤叶甲不同发育阶段均有表达,在幼虫期表达量最高,在卵和蛹期微量表达;在成虫滞育期间低表达,在滞育前与滞育结束后则有较高表达;在成虫发育过程中,头部的表达量显著低于腹部和胸部;高温(30-40℃)可诱导GdJHBP上调表达,在35℃时表达量达到最高值。【结论】沙葱萤叶甲GdJHBP属于血淋巴JHBP,在沙葱萤叶甲生长发育和成虫夏滞育中可能发挥着重要作用。     

沙葱萤叶甲核糖体蛋白基因GdRpS3a的克隆、分子特性及表达分析

核糖体蛋白(ribosomal protein,Rp)是一类参与蛋白质合成、细胞代谢、机体免疫及信号传导等重要功能的蛋白质.本研究旨在克隆沙葱萤叶甲Galeruca daurica核糖体蛋白S3a基因cDNA全长序列,分析其分子特性和表达模式,以期为进一步研究其在沙葱萤叶甲生长发育及滞育中的作用提供必要的基础.根据现有的沙葱萤叶甲转录组测序数据,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得了沙葱萤叶甲RpS3a基因的全长cDNA序列,命名为GdRpS3a(GenBank登录号:MN660144).该基因全长为800 bp,开放阅读框全长为687 bp,编码228个氨基酸,具有核糖体蛋白S3a家族的保守功能域;预测分子量为25.63 kDa,等电点pI为10.53,无信号肽和跨膜结构.同源序列比对和系统发育分析表明,GdRpS3a与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera RpS3a的亲缘关系最近,其氨基酸序列一致性最高为54.10％.采用qPCR技术检测该基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段(卵、1～3龄幼虫、预蛹、蛹及成虫羽化3、7、10、15、25、40、60、80和100 d)和3日龄成虫在不同温度(0、5、10、15、20、25、30、35和40℃)处理1h后的表达谱.结果 表明:GdRpS3a在不同发育阶段的沙葱萤叶甲体内均有表达,在成虫滞育结束后表达量最高,在卵期和成虫滞育期间低表达.温度对GdRpS3a的表达有显著的影响,30℃下最高,0℃下最低.GdRps3a的表达与沙葱萤叶甲生长发育阶段及环境温度有关,可能在沙葱萤叶甲成虫夏滞育中起着重要作用.     

沙葱萤叶甲化学感受蛋白基因的鉴定及表达谱分析（英文）

【目的】沙葱萤叶甲Galeruca daurica是一种在内蒙古草原上爆发成灾的新害虫。昆虫的化学感受蛋白(CSPs)是一类水溶性小分子蛋白,其主要功能是识别和传导环境中的化学刺激至受体,参与众多昆虫行为。本研究旨在鉴定沙葱萤叶甲化学感受蛋白基因,并对其表达谱进行分析。【方法】通过筛选本实验室组装的沙葱萤叶甲转录组鉴定沙葱萤叶甲化学感受蛋白基因;采用实时荧光定量PCR方法分析其在沙葱萤叶甲不同发育阶段(卵、1-3龄幼虫、蛹和成虫)和成虫组织[触角、头(去触角)、胸、腹、足和翅]中的表达水平。【结果】鉴定出10个化学感受蛋白基因,将其命名为Gdau CSP1-10(Gen Bank登录号:KY885471-KY885480)。10条编码蛋白的氨基酸序列一致性范围为17.27%~62.79%,彼此间分化程度较高。通过NCBI的Blast比对结果显示,Gdau CSPs与榆黄毛萤叶甲Pyrrhalta maculicollis的Pmac CSP氨基酸序列一致性最高,为90%。系统发育分析表明,4种Gdau CSPs首先与榆黄毛萤叶甲的Pmac CSPs聚为一支。实时荧光定量PCR结果显示,Gd CSPs在不同发育阶段中的表达量有显著差异,Gdau CSP4-5,Gdau CSP7-8和Gdau CSP10 5个Gd CSPs在成虫中的表达量显著高于其他发育阶段,而Gd CSP2在卵中的表达量显著高于其他发育阶段;Gd CSPs不仅表达于成虫触角中,在头(去触角)、胸、腹、足、翅等其他部位也有表达,且10个Gd CSPs在沙葱萤叶甲成虫各组织中有着不同的表达谱,其中Gdau CSP2,Gdau CSP4,Gdau CSP5,Gdau CSP8和Gdau CSP9 5个Gd CSPs在雌成虫触角中的表达量显著高于其他组织。【结论】结果提示化学感受蛋白在沙葱萤叶甲的生长发育和化学感受过程中可能起着不同的作用。本研究为进一步研究沙葱萤叶甲化学感受蛋白的生理功能及化学通讯的分子机理奠定了必要的基础。     

柑橘大实蝇滞育和非滞育蛹体内海藻糖含量的调控

【目的】通过比较柑橘大实蝇Bactrocera minax蛹滞育期与滞育前和滞育后以及滞育蛹与非滞育蛹体内海藻糖和葡萄糖含量的变化、海藻糖合成代谢途径中关键酶的活力变化以及关键酶基因的表达量变化,明确蛹滞育期间海藻糖合成代谢途径中关键酶对海藻糖含量的调控。【方法】利用分光光度法检测柑橘大实蝇滞育前(1日龄蛹)、滞育期(30,60和90日龄蛹)以及滞育后(120和150日龄蛹)蛹体内海藻糖与葡萄糖含量的变化,以及海藻糖合成代谢途径中的海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)、海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(TPP)和海藻糖酶(Tre)活力的变化;利用实时定量荧光PCR(qPCR)检测TPS,TPPB,TPPC-1,TPPC-2和Tre-1基因表达量的变化。向1日龄蛹体内注射20-羟基蜕皮酮(20E)作为处理(以注射10%乙醇为对照),分别于注射后1和30 d比较处理组与对照组蛹体内海藻糖与葡萄糖含量、关键酶活力以及上述基因表达量的差异。【结果】柑橘大实蝇蛹进入滞育后,海藻糖含量显著升高,葡萄糖含量无显著变化; TPS和TPP的酶活力以及TPS,TPPC-1和TPPC-2表达量在化蛹后逐渐升高,于滞育期达到最高水平,维持至羽化前显著下降;TPPB表达量在整个蛹期无显著差异; Tre酶活力以及Tre-1表达量在化蛹后逐渐升高,于滞育早期达到最高水平,随后显著下降,羽化前再次显著上升。注射20E后1 d,与对照组相比,处理组蛹体内海藻糖与葡萄糖含量、关键酶(TPS,TPP和Tre)活力以及TPS,TPPC-2和Tre-1表达量无显著变化,TPPB表达量显著下降,TPPC-1表达量显著上升;注射后30 d,与对照组滞育蛹相比,处理组非滞育蛹海藻糖含量显著上升,葡萄糖含量、TPS和Tre酶活力、TPS和Tre-1表达量显著下降,TPP酶活力以及TPPB和TPPC-2表达量无显著差异。【结论】柑橘大实蝇蛹体内海藻糖的含量在合成代谢途径中关键酶的调控下,随着滞育状态发生变化,表明海藻糖与滞育之间存在密切的关系,但其作用机理仍待进一步研究。     

沙葱萤叶甲热激蛋白基因GdHsp70的克隆与表达模式分析

【目的】本研究旨在克隆沙葱萤叶甲Galeruca daurica热激蛋白Hsp70基因,并对其进行序列和表达模式分析,探讨该基因在沙葱萤叶甲生长发育及响应温度胁迫方面的作用。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从沙葱萤叶甲2龄幼虫中克隆Hsp70基因,并进行生物信息学分析;用Wo LF PSORT在线软件进行亚细胞定位预测;采用实时荧光定量PCR检测该基因在沙葱萤叶甲成虫不同组织(头、胸和腹)中、不同发育阶段(卵、1-3龄幼虫、蛹、雌雄成虫)、不同温度(-14,-10,-5,0,5,10,15,20,25和30℃)处理1 h的2龄幼虫及0℃下分别处理0 min,15 min,30min,1 h,1.5 h,2 h和3 h时卵中的相对表达量。【结果】克隆获得一个沙葱萤叶甲Hsp70基因并命名为GdHsp70(GenBank登录号:KY460462),该基因全长2 340 bp,开放阅读框(ORF)1 899 bp,编码632个氨基酸,预测蛋白质分子量为70.12 k D,等电点(p I)为4.79,无跨膜区,无信号肽。蛋白质亚细胞定位预测该蛋白主要位于细胞质内。蛋白质结构域分析表明,GdHsp70有3个功能保守区。同源比对与系统进化分析表明,GdHsp70与分类学关系上较为接近的昆虫的同源蛋白间有较高的相似度。组织特异性和不同发育阶段表达分析表明,GdHsp70在沙葱萤叶甲成虫胸部和卵期表达量最高;高温和低温胁迫均能诱导沙葱萤叶甲2龄幼虫体内GdHsp70的表达,其中-10℃处理1 h表达量最高;0℃低温处理卵15 min至3 h后均能诱导GdHsp70不同程度的表达上调,其中处理1 h上调幅度最大。【结论】沙葱萤叶甲GdHsp70与该虫的生长发育相关,并对高低温胁迫的响应有重要作用。     

沙葱萤叶甲成虫不同夏滞育阶段的转录组分析(英文)

【目的】本研究旨在揭示内蒙古草原新害虫沙葱萤叶甲Galeruca daurica专性夏滞育相关的重要基因以及代谢通路。【方法】应用RNA-Seq技术,对沙葱萤叶甲成虫不同夏滞育阶段［滞育前期(PD)、滞育期(D)及滞育后期(TD)］进行转录组测序、分析及基因功能预测,基于RNA-Seq数据筛选夏滞育不同阶段差异表达基因;利用qPCR对基于RNA-Seq数据筛选的10个差异表达基因的表达水平进行验证。【结果】从9个文库中获得202 770 198 clean reads,将12 078 060条转录本组装获得82 292 条unigene,平均长度为783.59 bp,N50为1 545 bp。沙葱萤叶甲D vs PD和TD vs D 比较组分别有2 395(2 119上调和277下调)和62(59上调和3下调)个差异基因。KEGG分析表明,D vs PD和TD vs D比较组差异表达基因分别显著富集于糖孝解/糖异生通路和脂肪酸生物合成通路;此外,许多与钙离子信号转导相关的基因在滞育期间差异表达。10个差异表达基因的qPCR分析表明,RNA-Seq与qPCR结果高度一致。【结论】糖孝解/糖异生、脂肪酸生物合成及钙离子信号通路可能在沙葱萤叶甲滞育调节中起着重要的作用。本研究为进一步研究沙葱萤叶甲成虫专性夏滞育的分子机理奠定了基础。     

沙葱萤叶甲海藻糖磷酸酶基因GdTPP的克隆、原核表达及对温度胁迫的响应

【目的】海藻糖磷酸酶(Trealose-6-phosphate phosphatase,TPP)是参与昆虫海藻糖合成的关键酶之一。本研究旨在克隆和表达沙葱萤叶甲Galeruca daurica海藻糖磷酸酶基因,分析其对不同温度胁迫的响应,以期为进一步揭示其在沙葱萤叶甲生长发育及抗寒、耐热中的作用奠定基础。【方法】根据沙葱萤叶甲转录组数据,通过cDNA末端快速扩增(Rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆沙葱萤叶甲TPP的全长cDNA序列,并对该基因进行生物信息学分析;将该基因与pET28a载体链接构建表达载体,导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)使其表达;利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测TPP基因在沙葱萤叶甲2龄幼虫不同温度下的表达格局。【结果】克隆获得1条沙葱萤叶甲TPP基因cDNA全长序列(GdTPP,GenBank登录号:MG431210),该基因全长1 372 bp,开放阅读框(ORF)864 bp,编码287个氨基酸;蛋白预测分子量为32.32 ku,等电点(pI)为6.19;无信号肽和跨膜结构;包含2个N-糖基化位点;蛋白质亚细胞定位预测该蛋白位于细胞质中。同源性分析表明,GdTPP与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata TPP亲缘关系最近。成功构建原核表达载体pET28a-GdTPP,经IPTG诱导,GdTPP在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中高效表达。qPCR结果表明,低于25℃对照时,GdTPP表达量随着温度下降而上升,﹣10℃时达到最高值,为对照的1.82倍;高于25℃对照时,GdTPP表达量随着温度上升而上升,40℃时达到最高值,为对照的1.68倍。【结论】沙葱萤叶甲幼虫通过上调GdTPP的表达来应对高温和低温胁迫,该结果为进一步揭示TPP在昆虫应对温度胁迫过程中的作用奠定了基础。     

沙葱萤叶甲海藻糖合成酶基因GdTPS的克隆及对温度胁迫的响应

【目的】海藻糖合成酶(trealose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成过程中的关键酶之一。本研究旨在克隆沙葱萤叶甲Galeruca daurica海藻糖合成酶基因,分析其对不同温度胁迫的响应,以期进一步揭示沙葱萤叶甲耐温性的分子调控机制。【方法】通过RACE技术克隆沙葱萤叶甲TPS基因的全长cDNA序列,并对该基因进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法检测TPS基因在不同温度下沙葱萤叶甲2龄幼虫中的表达量变化。【结果】克隆获得沙葱萤叶甲TPS基因,将其命名为GdTPS(Gen Bank登录号:KY460114),该基因全长2 706 bp,开放阅读框(ORF)长2 496 bp,编码831个氨基酸;蛋白预测分子量为94.05 kD,等电点为6.82,无信号肽和跨膜结构,包含3个N-糖基化位点。GdTPS有两个保守功能区,与其他昆虫TPS具有较高的同源性,其中与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata TPS亲缘关系最近,氨基酸序列一致性为88%。实时荧光定量PCR结果表明,温度低于25℃(对照)时,GdTPS表达量随着温度下降而上升,-10℃时达到最高值;高于25℃时,GdTPS表达量随着温度上升而上升,40℃时达到最高值。【结论】沙葱萤叶甲幼虫通过上调GdTPS的表达来应对高温和低温胁迫,该结果为揭示TPS在昆虫应对温度胁迫过程中作用的分子机制提供了基础。     

稻纵卷叶螟海藻糖酶基因的克隆、分子特性和表达分析

【目的】海藻糖酶(trehalase,Tre)是昆虫体内海藻糖代谢的一个关键酶,包括可溶型(Tre1)和膜结合型(Tre2)两种类型,在昆虫发育和能量调节中具有重要作用。本研究旨在克隆稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis海藻糖酶基因(Cm Tre),解析其在稻纵卷叶螟不同发育阶段和不同组织中的表达模式,分析该基因及酶蛋白的分子特征。【方法】通过稻纵卷叶螟转录组数据结合RACE技术,克隆稻纵卷叶螟Cm Tre的全长c DNA序列,并对该基因进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)解析Cm Tre在稻纵卷叶螟不同发育阶段及成虫不同组织部位的m RNA表达模式。【结果】获得两种类型的稻纵卷叶螟Cm Tre基因,即可溶型海藻糖酶基因Cm Tre1和膜结合型海藻糖酶基因Cm Tre2。Cm Tre1的全长c DNA长度为2 364 bp,开放阅读框长1 704 bp,编码567个氨基酸;Cm Tre2的全长c DNA长度为2 079 bp,开放阅读框长1 923 bp,编码640个氨基酸。生物信息学分析表明,Cm Tre前端有一个信号肽,Cm Tre1无跨膜结构,Cm Tre2有一个跨膜结构。同源性和聚类分析表明,Cm Tre1和Cm Tre2的氨基酸序列与竹蠹螟Omphisa fuscidentalis海藻糖酶Tre1和Tre2氨基酸序列的一致性最高,分别为74%和79%。同源建模预测结果显示,Cm Tre1的三维分子结构包含19个α螺旋和2个β折叠片;Cm Tre2的三维分子结构含有23个α螺旋,没有β折叠片。RT-q PCR结果显示,Cm Tre在稻纵卷叶螟整个发育历期都有表达,在成虫期表达水平最高,在整个幼虫期都有相对稳定的表达;Cm Tre1在蛹期表达水平最低,Cm Tre2在5龄幼虫时期表达水平最低。Cm Tre在所检测的成虫组织(中肠、体壁、马氏管、头、卵巢、脂肪体、肌肉和精巢)中均有表达;Cm Tre1在中肠和体壁中的表达水平较高,Cm Tre2在肌肉和中肠中的表达水平较高。【结论】本研究克隆了稻纵卷叶螟两种类型的海藻糖酶基因,分析了其基因特征和表达模式。研究结果为阐明海藻糖酶基因的功能进而以海藻糖酶基因为靶标防治害虫奠定了基础。