直接用噬菌体肽进行功能性分析的研究

通过对胰蛋白酶抑制剂的筛选发现,噬菌体肽库不仅可以用于亲和性筛选,而且噬菌体肽（ｐｈａｇｅｐｅｐｔｉｄｅ——ｐｅｐｔｉｄｅｄｉｓｐｌａｙｉｎｇｏｎｐｈａｇｅ）可以直接用于对亲和筛选得到的克隆进行胰蛋白酶抑制实验,即所谓的功能性筛选．功能性筛选前后的测序结果表明用噬菌体肽直接进行功能性筛选确实能够筛去大部分的非抑制剂克隆．     

基于人HMGB1-B box的抑制性小肽筛选及其抗炎功能分析

目的从噬菌体构象型7肽库中筛选人HMGB1-Bbox的抑制性小肽。方法以重组人HMGB1-Bbox为靶分子对噬菌体构象型7肽库进行6轮亲和筛选,获得Bbox结合的克隆,并经ELISA验证。选取亲和力高的克隆进行DNA测序,并推导出呈现的多肽序列,通过IL-6 ELISA检测噬菌体呈现的小肽对人HMGB1-B box致炎功能的抑制作用。结果经过6轮亲和筛选,噬菌体的回收率增加,阳性克隆得到富集。挑选15个结合力强的克隆进行测序,推导出2个多肽序列。所获两个阳性噬菌体克隆能特异性地抑制人HMGB1-B box刺激THP-1细胞产生炎症因子的能力。结论获得了噬菌体呈现的能够抑制人HMGB1-B box的两个小肽。     

脑膜炎大肠杆菌IbeA蛋白结合肽序列的亲和筛选

应用噬菌体展示肽库技术,以重组的脑膜炎大肠杆菌致病蛋白IbeA作为靶分子,经过吸附-洗脱-扩增-再吸附的亲和筛选,随机挑选亲和力强的噬菌体克隆,进行ELISA、竞争抑制实验和序列测定。结果显示,经3轮淘选后,间接ELISA鉴定得到高亲和性结合IbeA蛋白的15个阳性克隆。竞争抑制实验结果表明,游离IbeA蛋白能竞争抑制噬菌体结合肽克隆与固相包被的IbeA蛋白的结合,其抑制作用随游离IbeA蛋白浓度的降低而减弱。测序结果得到5种阳性噬菌体克隆展示肽序列。上述结果提示以脑膜炎大肠杆菌IbeA蛋白为靶筛选所获得的噬菌体12肽克隆,具有特异性,其结合肽序列呈现相对保守性。建立的从噬菌体随机肽库筛选IbeA蛋白结合肽的方法具有方便、灵活和高效可行的特点。     

从噬菌体随机肽库中筛选流感病毒神经氨酸酶的抑制多肽

目的:从噬菌体呈现12肽库中筛选与流感病毒神经氨酸酶特异性结合的肽。方法:以甲三型流感病毒裂解疫苗原液为靶分子,经过3轮生物淘选,从噬菌体随机肽库中筛选与之结合的噬菌体。用ELISA方法鉴定噬菌体克隆与靶分子的结合力,用荧光方法测定噬菌体克隆对流感病毒A/Sydney/5/97(H3N2)神经氨酸酶的抑制活性。对筛选到的阳性克隆进行DNA序列测定并推导出相应的氨基酸序列。结果:经过3轮筛选后,42个噬菌体克隆与靶分子有高度亲和力,23个噬菌体克隆对流感病毒A/Sydney/5/97(H3N2)神经氨酸酶有抑制活性。对27个噬菌体克隆的测序结果表明,分别有10个和2个克隆的序列是一致的,其氨基酸序列分别为KSLSRHDHIHHH和WPRHHHSASVQT。结论:通过噬菌体肽库筛选到抑制流感病毒神经氨酸酶的12肽,为进一步研究对流感病毒神经氨酸酶有抑制活性的分子药物奠定了基础。     

脂多糖保守表位模拟肽的筛选与鉴定

用针对脂多糖保守表位的单抗2B4对噬菌体随机12肽库进行亲和筛选,通过噬菌体ELISA实验及脂多糖(LPS)竞争抑制实验鉴定阳性克隆.经三轮筛选后,与抗体结合的噬菌体得到明显富集,噬菌体ELISA结果显示,阳性率达80%.将其中12个阳性噬菌体克隆做鼠伤寒杆菌和大肠杆菌LPS竞争抑制实验,抑制作用非常明显,有良好的剂量依赖关系,证明这12个克隆与LPS具相似表位.DNA测序并推导噬菌体展示肽的氨基酸序列为,GPPQWFFSQPQL（5/12,41.7%）,LPQYFWNTATTA （3/12,25%）,FPQNHWNVPWAT（2/12,16.6%）,HSQSFWNAPLAM和AHPWTHGYFPPL（1/12,8.3%）.实验结果表明,用2B4抗体筛选到的噬菌体短肽克隆可模拟保守表位,即脂多糖的模拟肽（位）.     

脂多糖保守表位模拟肽的筛选与鉴定

用针对脂多糖保守表位的单抗2B4对噬菌体随机12肽库进行亲和筛选,通过噬菌体ELISA实验及脂多糖(LPS)竞争抑制实验鉴定阳性克隆.经三轮筛选后,与抗体结合的噬菌体得到明显富集,噬菌体ELISA结果显示,阳性率达80%.将其中12个阳性噬菌体克隆做鼠伤寒杆菌和大肠杆菌LPS竞争抑制实验,抑制作用非常明显,有良好的剂量依赖关系,证明这12个克隆与LPS具相似表位.DNA测序并推导噬菌体展示肽的氨基酸序列为,GPPQWFFSQPQL（5/12,41.7%）,LPQYFWNTATTA（3/12,25%）,FPQNHWNVPWAT（2/12,16.6%）,HSQSFWNAPLAM和AHPWTHGYFPPL（1/12,8.3%）.实验结果表明,用2B4抗体筛选到的噬菌体短肽克隆可模拟保守表位,即脂多糖的模拟肽（位）.     

利用噬菌体展示肽库筛选鸡传染性支气管炎病毒模拟抗原表位

目的：利用噬菌体展示肽库技术筛选鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的模拟抗原表位。方法：用IBV阳性血清纯化IgG作为靶标。对噬菌体展示随机12肽库进行筛选，通过ELISA和竞争抑制ELISA鉴定筛选克隆的结合特性，并对阳性克隆提取ssDNA进行测序分析。结果：3轮生物淘洗后，目标噬菌体得到125倍富集。随机挑选50个克隆进行ELISA和竞争抑制ELISA。其中有12个噬菌体克隆可以与IBV阳性血清高特异性结合。测序分析发现，这12个克隆带有2种氨基酸序列。即KSPKHSSSALHF和SFFQLNLHRPTS。且未发现这2种序列与GenBank中已发表的IBV氨基酸序列有同源性。结论：结果提示。这2个肽可能是IBV抗原的模拟表位。     

脑膜炎大肠杆菌IbeA蛋白结合肽序列的亲和筛选*

应用噬菌体展示肽库技术,以重组的脑膜炎大肠杆菌致病蛋白IbeA作为靶分子,经过吸附-洗脱-扩增-再吸附的亲和筛选,随机挑选亲和力强的噬菌体克隆,进行ELISA、竞争抑制实验和序列测定。结果显示,经3轮淘选后,间接ELISA鉴定得到高亲和性结合IbeA蛋白的15个阳性克隆。竞争抑制实验结果表明,游离IbeA蛋白能竞争抑制噬菌体结合肽克隆与固相包被的IbeA蛋白的结合,其抑制作用随游离IbeA蛋白浓度的降低而减弱。测序结果得到5种阳性噬菌体克隆展示肽序列。上述结果提示以脑膜炎大肠杆菌IbeA蛋白为靶筛选所获得     

利用噬菌体随机肽库筛选可结合猪繁殖与呼吸综合症病毒的多肽序列

【目的】采用完整的猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)颗粒筛选噬菌体肽库,以获得能高亲和力结合并能抑制该病毒复制的特异性多肽。【方法】用纯化的病毒粒子包被ELISA板,再用M13噬菌体随机12肽库进行筛选。经过3轮淘筛,ELISA鉴定噬菌体单克隆与PRRSV的亲和力,选取与PRRSV具有高亲和力的噬菌体单克隆进行DNA测序,据此推导多肽的氨基酸序列。通过TCID50检测其抗病毒复制能力,同时人工合成FITC标记的展示肽用于PRRSV的检测。【结果】经筛选和鉴定得到17个阳性噬菌体克隆能与PRRSV呈高亲和力结合,DNA测序发现各克隆之间有部分共有基序,其中2个克隆体外能明显抑制PRRSV的复制,使TCID50由10-7.3/0.1mL分别降至10-3.2、10-3.6/0.1mL,而FITC标记该展示肽能够在5mg/L工作浓度检测PRRSV。【结论】通过噬菌体肽库能够筛选到具有抗病毒作用的阳性噬菌体克隆,为进一步开发高效PRRSV的诊断和治疗试剂奠定基础。     

从噬菌体展示肽库中筛选脂质A的结合肽

以脂质A为靶标,筛选噬菌体展示十二肽库,三轮后随机挑取14个噬菌体克隆进行结合活性鉴定,并对5个克隆进行序列分析。结果表明,14个克隆全部是阳性克隆,测序结果显示4个阳性克隆的序列完全一样。说明筛选到了一个脂质A的结合多肽。     

BLyS对噬菌体随机12肽库的筛选

用B淋巴细胞刺激因子（BLyS）对噬菌体随机12肽库进行亲和淘洗,3轮筛选后阳性噬菌体得到富集。用ELISA鉴定噬菌体克隆,多个阳性克隆测序后得到了同一个小肽序列(RHKIQLRQNIIT)。将该小肽与GST融合,在大肠杆菌中进行表达及纯化,ELISA实验进一步验证了其具有与BLyS特异结合的活性。该小肽有可能成为其天然受体的拮抗剂。      

从噬菌体表面展示肽库中筛选志贺毒素受体结合抑制剂

利用抗体捕获法 ,从表面展示随机肽序列的噬菌体文库中筛选到与志贺毒素B亚基 (StxB)结合 ,并能抑制志贺毒素细胞毒效应的噬菌体克隆 ;依据其中 1个克隆序列 (A12 )合成的肽可以与志贺毒素的受体Gb3竞争结合StxB ,并抑制志贺毒素(Stx)的细胞毒和肠毒活性 ;抑制 5×CD₅₀ 剂量的Stx细胞毒效应需 2 2 .7μmol的A12合成肽 .筛选得到的 2个噬菌体克隆 (A3 ,A12 )编码的氨基酸序列不同 ,但能竞争结合StxB ,推测它们形成相同或相似的空间结构 .为志贺毒素抑制剂进一步研究打下基础 ,对其他相关药物的研制亦有参考价值 .     

用噬菌体随机肽库筛选SARS冠状病毒S蛋白单克隆抗体2C5的模拟表位

SARS-CoVS蛋白特异的单克隆抗体2C5具有病毒中和作用。以单克隆抗体2C5为筛选靶分子,筛选噬菌体展示随机7肽库。经三轮淘洗后随机挑选20个噬菌体克隆进行ELISA分析和序列测定。在10个ELISAOD值大于0.2的阳性噬菌体克隆中,有8个噬菌体克隆展示有共同的7肽序列TPEQQFT。展示有该序列的噬菌体克隆能竞争抑制SARS-CoVS蛋白抗原与单抗2C5的结合。结果表明TPEQQFT为单克隆抗体2C5的模拟表位。该结果可对进一步研究S蛋白结构与功能和设计SARS疫苗有一定的参考意义。     

脓毒症单核巨噬细胞特异性结合肽的筛选

利用噬菌体随机肽库展示技术,筛选出与脓毒症单核/巨噬细胞特异性结合的短肽,探索脓毒症治疗的新方法.分别以经过脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)处理的人外周血单核细胞株(THP-1)细胞作为筛选的靶细胞,以未经LPS处理的THP-1细胞作为非特异性噬菌体吸附细胞,对噬菌体随机环七肽库进行4轮“差减"筛选,经过细胞ELISA验证阳性噬菌体克隆,对获得的阳性克隆进行DNA测序及生物信息学分析,并进一步利用免疫荧光实验,鉴定噬菌体克隆与LPS处理THP-1细胞的结合特异性.4轮筛选后,随机挑取的噬菌体克隆,测序后得到可与LPS处理的THP-1细胞特异性结合肽.对去冗余后的七肽进行Clustal W多序列比对分析和BlastP蛋白同源相似性分析,细胞免疫荧光检测确定获得的噬菌体展示七肽可与LPS处理的THP-1细胞特异性结合.噬菌体随机肽库技术为脓毒症单核/巨噬细胞表面靶位的筛选提供了高效、快捷的筛选体系,实验获得的多肽基序具有高度保守性和细胞特异性,这些多肽的生物活性将是下一步的研究内容.     

利用噬菌体肽库筛选与HIV-1p24抗原结合的多肽

通过噬菌体展示技术筛选出与HIV-1p24抗原结合的多肽,为用多肽辅助p24抗原检测提供实验基础.以重组p24抗原为靶蛋白,对噬菌体随机七肽库进行三轮筛选,用EUSA鉴定第三轮筛选到的噬菌体克隆与p24重组抗原的结合能力,再对噬菌体克隆进行测序分析,同时研究了ELISA中噬菌体加入量及多种封闭剂对噬菌体特异性结合能力的...     

胰凝乳蛋白酶短肽抑制剂的筛选和活性分析

报道了一种从噬菌体肽库中筛选胰凝乳蛋白酶短肽抑制剂的新方法．在通常的亲和富集筛选的基础上,利用胰凝乳蛋白酶自身的水解活力切割掉结合的底物噬菌体,再经抑制活力分析得到抑制性噬菌体克隆．这样筛得的噬菌体克隆具有明显的胰凝乳蛋白酶结合活力和抑制活力,ＤＮＡ序列分析发现其保守序列为（Ｓ／Ｔ）ＲＶＰＲ（Ｒ／Ｈ）．按此序列化学合成的短肽Ａｃ－ＡＳＲＶＰＲＲＧ－ＮＨ２、Ａｃ－ＡＳＲＶＰＲＨＧ－ＮＨ２同样表现出对胰凝乳蛋白酶的抑制作用．该方法为蛋白酶短肽抑制剂的筛选提供了一条有效途径     

bFGF特异性结合噬菌体的活性研究

研究从噬菌体随机7肽库中筛选的bFGF特异性结合噬菌体的活性。采用ELISA检测3轮淘选后得到的阳性噬菌体克隆对bFGF的结合曲线。通过竞争抑制实验,分析bFGF结合噬菌体与bFGF的竞争结合活性。采用MTT法检测bFGF结合噬菌体对由bFGF诱导的Balb/c3T3细胞增殖的影响。从噬菌体肽库中淘选获得的阳性噬菌体克隆能够特异地与bFGF结合,并呈剂量依赖性,其与固相bFGF的结合能被游离的bFGF竞争抑制,并可抑制由bFGF诱导的Balb/c3T3细胞增殖。bFGF特异性噬菌体可拮抗bFGF的活性,为开发针对bFGF的抗肿瘤短肽类新药提供基础。     

利用噬菌体随机肽库筛选抗柯萨奇病毒B3多肽的研究

本实验将柯萨奇病毒B3型(CVB3)大量扩增,应用蔗糖密度梯度离心法纯化病毒。利用噬菌体随机9肽库进行筛选,3轮淘洗后,测定噬菌体克隆抗病毒复制能力。提取阳性克隆DNA并进行测序,推导外源多肽的氨基酸序列。结果表明:3个具有明显抗病毒复制能力的噬菌体阳性克隆被筛选出来,使TCID50由10-7.5SFU/mL分别降至10-5.25、10-6、10-5.5SFU/mL,由此证明可以应用噬菌体肽库来筛选具有抗病毒作用的多肽,本研究为抗病毒多肽制剂的研究奠定了基础。     

表位九肽库的构建及人Ⅳ型胶原酶特异结合肽的筛选

将人工合成的编码九肽的随机序列DNA片段克隆进丝状噬菌体表达载体FUSE5,经多次电击转化和表达,获得肽段与噬菌体pⅢ蛋白融合并展示在噬菌体表面的随机序列九肽表位肽库。库容量达10 10个克隆。以Ⅳ型胶原酶为靶蛋白,采用亲和纯化筛选模式,从中筛选出Ⅳ型胶原酶结合肽。进一步ELISA检测筛选出与Ⅳ型胶原酶特异结合的20个阳性克隆。序列分析发现一组肽含有WDXXD的共同序列,一组含有WVGXXR的共同序列。其中WDXXD的序列与Ⅳ型胶原酶单链抗体可变区序列同源。结果表明,多肽库是筛选蛋白特异结合肽的有力工具,表位九肽库的构建和筛选方法的建立为进一步应用筛选具有高亲和力的特异结合肽奠定了基础。     

利用噬菌体随机肽库筛选抗柯萨奇病毒B3多肽的研究

本实验将柯萨奇病毒B3型(CVB3)大量扩增,应用蔗糖密度梯度离心法纯化病毒.利用噬菌体随机9肽库进行筛选,3轮淘洗后,测定噬菌体克隆抗病毒复制能力.提取阳性克隆DNA并进行测序,推导外源多肽的氨基酸序列.结果表明3个具有明显抗病毒复制能力的噬菌体阳性克隆被筛选出来,使TCID50由10-7.5SFU/mL分别降至10-5.25、10-6、10-5.5SFU/mL,由此证明可以应用噬菌体肽库来筛选具有抗病毒作用的多肽,本研究为抗病毒多肽制剂的研究奠定了基础.