胡萝卜毛状根的诱导及条件优化

以发根农杆菌A4、LBA9402、R1000为实验菌株,从胡萝卜中成功诱导出可在无激素条件下快速生长的毛状根,通过PCR方法对其进行了初步鉴定.该毛状根在MSR培养基上生长迅速,1个月左右即可长满整个平板,并经多次继代后仍保持其特性.研究了菌株类型、培养基、菌液量、菌液浓度和共培养天数对胡萝卜毛状根转化频率的影响,筛选出的较优胡萝卜发根条件为:使用A4发根农杆菌菌株,共培养培养基为添加50 mg/L Vitamin C(Vc)的水琼脂,加菌量20 μL,侵染液OD600值0.6,共培养天数2 d.胡萝卜毛状根诱导体系的建立和条件优化为其他植物毛状根的诱导提供了技术参考,同时为进一步研究胡萝卜的次生代谢及建立菌根共生体系等奠定了基础.     

4种发根农杆菌对朱砂根组培无菌叶片毛状根诱导的影响

以朱砂根(Ardisia crenata Sims)组培无菌叶片为材料,用4种发根农杆菌菌株(A4、ATCC15834、LBA9402和R1601)分别侵染进行毛状根诱导,比较朱砂根叶片毛状根诱导的最适培养基种类、预培养时间、侵染方式、共培养时间以及不同发根农杆菌的致根能力。研究表明:(1)朱砂根无菌叶片毛状根诱导最适培养基为1/2MS培养基,预培养2d、共培养2d,毛状根诱导率最高(31.87%)。(2)最佳侵染方式以剪好的幼叶和活化好的菌液(100mg/L AS)一起在28℃、180r/min黑暗条件下共振荡8~15min。(3)4种发根农杆菌均能诱导朱砂根叶片毛状根产生,但A4、ATCC15834效果最好,其致根能力大小顺序依次为ATCC15834A4LBA9402R1601。(4)PCR分子鉴定表明,发根农杆菌Ri质粒T-DNA已成功整合到宿主细胞核基因组中。     

喜树毛状根的诱导及其喜树碱含量分析

研究了不同外植体类型(包括真叶、茎段、子叶及胚轴)、胚轴年龄和不同发根农杆菌菌株(包括A4、15834、R1601、C58C1)等因素对喜树毛状根诱导频率的影响,并用PCR对诱导出的毛状根进行了分子鉴定.结果表明:(1)最佳外植体为胚轴,5~10 d是胚轴最佳诱导年龄段,最佳诱导菌株为15834.(2)PCR鉴定结果表明,发根农杆菌的rolB基因已整合到喜树毛状根基因组中.(3)对不同菌株诱导的毛状根进行HPLC检测表明,C58C1菌株诱导的毛状根的喜树碱和羟基喜树碱含量最高,分别为1.219 mg/g和0.305 mg/g.研究结果为喜树碱的药源开发提供了一条新途径,并为进一步利用基因工程技术调控喜树碱的代谢合成奠定了基础.     

银杏毛状根褐化机制的初步研究

该实验依据现有发根农杆菌侵染法,以银杏无菌苗叶片为外植体,对农杆菌诱导银杏毛状根的实验操作进行优化,并观察记录银杏毛状根继代生长情况,测定继代不同天数的毛状根组织内多酚含量、多酚合成相关酶基因和POD基因相对表达量,以探讨银杏毛状根褐化的生理机制。结果显示:(1)银杏农杆菌侵染最适预培养时间为3d、菌种为R1601、共培养基为White、侵染时间为30min,优化侵染操作后的银杏毛状根诱导率可达72.36%;银杏毛状根继代生长的最适IBA浓度为0.5mg/L。(2)银杏毛状根初始发根时颜色为乳白色,多在伤口处簇生,伸长生长时无向地性,不分叶正背面都能在伤口处诱导出根,且在除菌培养20d时毛状根长可达0.4～0.8cm;继代培养25d时毛状根为白色,继代35d时部分毛状根从根部至中部开始转黄,继代45d时大部分毛状根由白转黄,根部至中部开始有褐化出现。(3)继代35d时毛状根的PAL、C4 H、4CL和POD基因表达量分别为25d的68%、44%、51%、52%;继代45d时PAL、C4 H、4CL、POD基因表达量分别为35d的19%、75%、86%、105%。(4)继代35d、45d的银杏毛状根总酚类含量分别为17.14和13.78mg/g。研究发现,PAL基因表达量变化与其下游的两个关键酶基因(C4 H、4CL)表达量变化不一致,且PAL基因表达量的大幅降低并未对下游C4 H、4CL基因表达有明显影响,说明PAL基因表达量变化对其下游合成速率影响不大,可能不是银杏毛状根苯丙氨酸代谢途径的限速酶;而C4 H与4CL基因表达量变化趋势高度一致,说明C4H应是该途径中的限速酶之一;推测继代前期可能是由PPO作为关键酶参与毛状根褐化反应,导致后期毛状根生长受抑制,POD基因表达水平随之上升,POD参与褐化反应。     

发根农杆菌诱导桑树毛状根体系的建立

应用发根农杆菌ACCC10060,以直接接种和共培养2种方法侵染桑树10 d龄子叶,并将2种处理的外植体分别接种于MS+AS(乙酰丁香酮,100 μmol/L)的平板,暗培养2 d后转接至MS+CS(头孢霉素,200 mg/L)平板培养3周,每3 d转接1次以除去其中所含的发根农杆菌菌体,结果2种侵染方法均成功诱导桑树产生毛状根,诱导效率分别为14%和17%.在无激素MS培养基上离体培养除菌后的毛状根,呈现旺盛的生长态势和典型的发状根结构特点.CTAB法提取毛状根基因组并进行PCR检测,结果扩增出了423 bp的rolB基因片段,表明Ri质粒的T-DNA已经成功整合到桑树的基因组中.     

发根农杆菌介导的菠菜毛状根遗传转化体系的建立

发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染植物后可诱导植物产生毛状根。菠菜(Spinacia oleracea)是常见的食用蔬菜, 目前尚未见菠菜毛状根的研究报道。经筛选得到适合诱导菠菜毛状根的发根农杆菌菌株LBA9402, LBA9402侵染菠菜外植体茎后, 毛状根的诱导率最高可达16%。菠菜毛状根呈白色, 具有丰富的根毛, 能在无外源激素的固体培养基上快速增殖生长。通过诱导菠菜毛状根产生愈伤组织并进行分化, 获得了菠菜毛状根的再生植株, 再生率为8%。此外, LBA9402可将含有Ri质粒的T-DNA和携带外源GFP基因的Ti质粒T-DNA共同导入外植体中。PCR检测和荧光显微观察结果显示, rolB及GFP基因在菠菜毛状根基因组中稳定表达, 共转化频率为50%。     

发根农杆菌介导的菠菜毛状根遗传转化体系的建立

发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染植物后可诱导植物产生毛状根。菠菜(Spinacia oleracea)是常见的食用蔬菜, 目前尚未见菠菜毛状根的研究报道。经筛选得到适合诱导菠菜毛状根的发根农杆菌菌株LBA9402, LBA9402侵染菠菜外植体茎后, 毛状根的诱导率最高可达16%。菠菜毛状根呈白色, 具有丰富的根毛, 能在无外源激素的固体培养基上快速增殖生长。通过诱导菠菜毛状根产生愈伤组织并进行分化, 获得了菠菜毛状根的再生植株, 再生率为8%。此外, LBA9402可将含有Ri质粒的T-DNA和携带外源GFP基因的Ti质粒T-DNA共同导入外植体中。PCR检测和荧光显微观察结果显示, rolB及GFP基因在菠菜毛状根基因组中稳定表达, 共转化频率为50%。     

培养基种类对花生毛状根株系生物量和白藜芦醇含量的影响

旨在研究不同培养基对花生毛状根株系生物量和白藜芦醇含量的影响。利用发根农杆菌R1601侵染花生的叶片,诱导毛状根,利用PCR技术检测毛状根。使用5种培养基(1/2MS、MS、MS+500 mg/L羧苄西林钠、B5和N6)分别培养同一个株系的花生毛状根,4周后利用高效液相色谱法(HPLC)测量毛状根生物量和白藜芦醇含量。结果显示,不同培养基对花生毛状根株系生物量的积累有显著差异,1/2MS培养基和MS培养基有利于花生毛状根株系生物量的积累。不同培养基对花生毛状根株系中白藜芦醇的含量有显著差异,B5培养基和N6培养基有利于花生毛状根株系中白藜芦醇的积累。     

不同理化因子对黄芩毛状根诱导的影响

目的:利用发根农杆菌1.2556诱导黄芩,得到毛状根.方法:采用共培养法诱导黄芩毛状根,研究不同外植体,不同预培养时间,不同菌液浓度,不同感染时间,乙酰丁香酮,抗生素浓度等条件对转化率的影响.结果:利用预培养2d后的茎段为转化材料,当发根农杆菌浓度在OD600值为0.5时感染10min,转化率最高.在菌液中或培养基中添加100umol/L,乙酰丁香酮可以提高黄芩毛状根的转化效率.培养基中加入250mg/L抗生素Cef能较好地抑制发根农杆菌生长.结论:用共培养法诱导出黄芩毛状根,并确定了最佳诱导条件,以提高黄芩外植体的诱导率.     

重金属超富集植物东南景天毛状根的诱导

为建立重金属超富集植物东南景天(Sedum alfredii)的毛状根诱导体系,采用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)A4侵染叶片,研究了预培养时间、侵染时间和共培养时间对毛状根诱导率的影响。结果表明,东南景天叶片外植体的预培养时间为48 h、农杆菌侵染时间为6 min、共培养时间为48 h是适宜的毛状根诱导时间,毛状根的诱导率可达85%。PCR检测表明诱导的毛状根中存在rol B基因片段。这是东南景天首次建立用发根农杆菌诱导毛状根体系。     

发根农杆菌介导的尾巨桉遗传转化体系的建立

发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）的建立对植物功能基因的验证具有重要意义,为了在桉树（Eucalyptus）中建立发根农杆菌介导的遗传转化体系,本研究以不同的发根农杆菌菌株侵染尾巨桉（Eucalyptus urophylla × E. grandis）的叶片和茎段,确定合适的农杆菌菌株和外植体类型,在此基础上开展农杆菌浓度、侵染时间对毛状根诱导的影响。结果表明：采用发根农杆菌菌株MSU440,以叶片为外植体进行发根诱导,最高获得了81.0%的毛状根诱导率,毛状根平均根长达到3.23 cm。在发根农杆菌浓度为OD₆₀₀=0.3、侵染时间为30 min时,共培养48 h后经过20 mg·L^-1卡那霉素筛选培养,通过PCR分子鉴定和GUS染色证实外源基因稳定地整合在桉树毛状根基因组中,转化率达20.2%。初步建立了发根农杆菌介导的桉树遗传转化体系,为桉树基因功能鉴定和进一步的转基因育种奠定基础。     

美洲商陆毛状根诱导及其离体培养的影响因素

为了探讨利用美洲商陆毛状根生产其药用成分的可能性,研究了美洲商陆毛状根诱导及其离体培养的影响因素。结果表明,美洲商陆叶片外植体被发根农杆菌ATCC 15834感染约18 d后,从其叶片外植体形态学下端叶脉切口处产生毛状根,其中以预培养1 d,农杆菌感染20 min,共培养4 d时的毛状根诱导率最高,达到70%。PCR扩增和硅胶薄层层析结果显示,发根农杆菌Ri质粒的rol C基因以及冠瘿碱合成酶基因已在美洲商陆毛状根基因组中整合和表达。所获得的美洲商陆毛状根系都能在无外源激素的MS固体培养基上快速自主生长;其中以毛状根根系2的生长速度最快、分生侧根能力最强和根表面的根毛密度最高;毛状根根表面呈紫红色或呈白色。在供试的MS、1/2MS、B5和6,7-V液体培养基中,以无外源激素的MS培养基最适合美洲商陆毛状根根系生长。与无外源激素的MS培养基相比,6,7-V培养基更有利于毛状根中商陆皂苷甲的合成与积累。本文所建立的美洲商陆毛状根诱导及其离体培养的适宜条件为今后利用其毛状根株系的规模培养来生产其药用有效成分商陆皂苷甲奠定了实验和技术基础。     

蔗糖对发根农杆菌C58C1诱导烟草毛状根生长的影响北大核心CSCD

毛状根良好的生长状况是建立毛状根-AM真菌双重培养体系的关键,为优化毛状根培养基成分,确定适宜毛状根生长的蔗糖浓度,改善烟草毛状根的生长状况,该研究以发根农杆菌菌株C58C1诱导2个烟草品种NC82和Va116叶片产生毛状根,经PCR检测证实后,用含有不同蔗糖浓度的1/2MS培养基分别进行固体和液体优化培养,通过测定毛状根的分枝数、鲜重(FW)与干重(DW),研究蔗糖对2个品种烟草毛状根生长的影响。结果表明:(1)C58C1均能诱导两种烟草叶片产生毛状根,但诱导率不同,NC82(87.3%)的诱导率更高,是Va116(38.6%)的2.26倍。(2)培养基蔗糖浓度显著影响毛状根生长,因烟草品种和起始分枝数而异。(3)固体培养基优化培养NC82和Va116的毛状根,分枝数增长的抑制蔗糖浓度分别为25 g·L^(-1)和15 g·L^(-1);液体培养基优化培养分别在25 g·L^(-1)和15 g·L^(-1)时F(D)W达到最大,分别为0.541 g(0.055 g)、0.474 g(0.050 g)。(4)综合分枝数、F(D)W、毛状根生长势考虑,C58C1诱导NC82毛状根最适培养基蔗糖浓度为25 g·L^(-1),Va116毛状根为15 g·L^(-1)。该文优化了烟草毛状根培养基组成的适宜蔗糖浓度及培养方法,为后续毛状根大量扩繁奠定基础,建立了毛状根-AM真菌双重培养体系,解决了关键的寄主生长不良的问题。     

寄生植物锁阳种子萌发方法及愈伤组织、初生吸器诱导研究

专性寄生植物锁阳以干燥肉质茎入药,为常用中药材。在锁阳的生活史中,需要经历种子萌发、芽管状器管伸长、初生吸器形成、次生吸器形成等过程,其中种子萌发和初生吸器形成是锁阳完成生活史的最基本条件。目前,触发锁阳种子萌发、初生吸器形成的植物生长调节物质的阈值和种类并不清楚,导致人工调控锁阳生活史困难及栽培收益不高。本论文运用组织培养方法,研究赤霉素、生长素和细胞分类素等多种激素交互作用对锁阳种子萌发和吸器形成的影响。研究结果显示：（1）多种激素的共同作用促进锁阳球形原胚的发育。（2）B₅培养基添加1.0 mg·L^-1 2,4-D,0.5 mg·L^-1 KT,1.0 mg·L^-1 GA₃可以高效诱导锁阳种子愈伤组织形成,愈伤诱导率达13.7％±3.1%。（3）B₅培养基添加0.5 mg·L^-1 2,4-D,0.25 mg·L^-1 KT可以高效诱导锁阳愈伤组织分化初生吸器,一些初生吸器继续分化成芽管状气管,延伸3~4 cm后,顶端膨大,形成新的初生吸器。本论文研究结果可为进一步研究锁阳种子萌发、初生吸器形成的内源激素变化规律及发生机制研究奠定基础。     

光对商陆发状根生长和PAP基因表达的影响

利用发根农杆菌菌株Ar1334与美洲商陆(Phytolacca americana)叶片外植体共培养转化体系,共获得58个发状根无性系(SL-1~58).以发根农杆菌Ri质粒TL-DNA上的rol C基因设计特异引物,对发状根进行PCR检测,得到了预期的560 bp目的片段,表明Ri质粒T-DNA整合到发状根基因组中.将筛选出的株系SL-7接种在MS培养基上分别置于光、暗条件下进行培养.结果发现:SL-7在暗培养条件下呈乳白色,具有多分枝、多根毛、无向地性等典型的发状根特性;在光培养条件下,发根呈粉红色,少分支且生长缓慢;以商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein,PAP)cDNA片段为探针,分别对光、暗条件下的发状根进行Northern blot检测,发现光对PAP基因的转录具有一定抑制作用;将发状根粗蛋白提取液与TMV病毒液混合后,摩擦接种于心叶烟(Nicotiana glutinosa)离体叶片,发现暗培养的发状根粗蛋白提取液对TMV抗性明显提高.表明商陆发状根的生长及PAP基因的表达都受到光的负向调控.该结果为商陆发状根的规模化培养和PAP蛋白的离体合成优化体系的建立奠定了基础.     

Sesame hairy root cultures for extra-cellular production of a recombinant fungal phytase

Sesame (Sesamum indicum L.) hairy roots were transformed with a fungal (Aspergillus) phytase and their culture conditions were surveyed for the extra-cellular production of the recombinant phytase protein in shake flasks. Kanamycin resistance of sesame hairy roots was observed at 50 μg ml⁻¹ kanamycin sulfate and southern hybridization analysis confirmed the existence of the phytase gene in the hairy root genomic DNA. The continuous dark condition was more effective for both the root growth and phytase production than light. Slightly higher root growth was determined at 30 °C than 26 °C in Murashige & Skoog (MS) medium supplemented with 3% sucrose, while the final phytase production was greatest in MS medium with 5 or 3% sucrose at both temperatures of 26 and at 30 °C. Among the culture media used, full-strength MS medium was exclusively efficient for production of the recombinant phytase. Most rapid increase rates in both the root growth and phytase production were detected at the 4th week of the culture periods and thereafter their rates began to decrease. Our results indicated that 5–6-week culture periods may be necessary for the maximal phytase production. Western analysis revealed that even though the phytase proteins expressed were measured with greater activities in the liquid medium than in the root tissues, they were still retained in the tissues.     

北玄参毛状根诱导及其植株再生

利用发根农杆菌A4和R1601感染北玄参(Scrophularia buergeriana)叶片外植体,诱导产生毛状根,产生的毛状根可在无激素的液体和固体MS培养基上快速生长。rol B基因的PCR检测表明,Ri质粒中的T-DNA片段整合到了北玄参毛状根的基因组中。毛状根在附加0.5 mg·L–1 6-BA及0.1 mg·L–1 NAA的MS固体培养基上形成绿色愈伤组织,之后形成不定芽,并获得再生植株;毛状根在附加0.5 mg·L–1 6-BA及0.02 mg·L–1 NAA的MS固体培养基上培养约15–20天可直接形成不定芽,且不定芽的诱导率达85%。