大腹园蛛鞭状腺蛛丝蛋白N端结构域的克隆表达及圆二色谱分析

鞭状腺蛛丝是6种蛛丝中延展性最好的丝,由鞭状腺蛛丝蛋白(FlSp)构成,具有极大的潜在应用价值。目前,有关FlSp的末端功能模块(NT和CT)编码基因的报道极少,且其结构和功能均尚未明确,这在一定程度上限制了鞭状腺蛛丝的仿生。现利用5′-RACE的方法,以大腹园蛛总RNA和基因组DNA为模板,首次获取了大腹园蛛FlSp NT模块(FlSp_A.v-NT)的完整编码基因,并对其成功进行了克隆、表达及纯化,产量可达60 mg/L;同时,利用圆二色谱(circular dichroism,CD)对FlSp_A.v-NT的二级结构进行了分析,结果显示其主要以α螺旋构象存在,这是首次对FlSp NT的二级结构进行探索,为后续FlSp NT结构功能的研究提供了材料,奠定了研究基础。     

盐离子对次壶腹腺丝蛋白重组模块的影响

为研究不同生理环境对蛛丝蛋白组装及成丝的影响,首次以MiSp序列为对象,研究其NTR1SR2CT重组模块在不同种类(浓度)盐离子条件下的聚集和成纤维特性及其在成纤维过程中二级结构的变化。基于大腹园蛛MiSp全长序列构建NTR1SR2CT模块,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21中成功表达。借助8 mol/L尿素裂解包涵体进行变性纯化得到NTR1SR2CT重组蛋白。NTR1SR2CT重组蛋白二级结构主要为无规则卷曲(Random coil)或α螺旋(Helix),在自然成丝及冻干过程中部分random coil或helix转变为β折叠(β-sheet),甲醇能促进该转变过程。另外,钾离子和磷酸根离子有利于NTR1SR2CT重组蛋白聚集从而促进丝纤维的形成。研究结果为成丝机理研究奠定了基础,同时也为工业化生产高品质的蛛丝纤维提供了条件。     

大腹圆蛛Fosmid文库的构建及MaSp基因筛选方法的探讨

介绍了构建大腹圆蛛Fosmid基因组文库及牵引丝蛋白(MaSp)基因克隆筛选的全过程.采用改良CTAB法提取大片段基因组DNA,通过自主构建的电洗脱核酸回收装置分离回收30～40kbDNA片段,经补平磷酸化、与pCC2FOS载体连接、体外包装和转染EPI300TM-T1R,首次构建了无偏向性的大腹圆蛛Fosmid文库,其滴度为4.5×105cfu/mL,覆盖基因组倍数为10.以α-32P标记寡核苷酸探针对文库进行初步筛选,获得含MaSp基因的12个阳性克隆.该文库符合Fosmid文库的品质要求,为进一步筛选并研究大腹圆蛛MaSp基因序列奠定了基础.     

大腹园蛛大壶状腺丝蛋白-1基因部分cDNA的克隆和序列分析

大腹园蛛大壶状腺表达拖丝蛋白新基因的克隆, 为进一步研究蛛丝蛋白基因以及人工表达蛛丝蛋白提供参考依据。文章利用“通用方法”即反转录—置换法构建大腹园蛛(Araneus ventricosus)大壶状腺(Major ampullate gland) cDNA文库, 并筛选出具有典型重复结构的大腹园蛛大壶状腺丝蛋白-1部分cDNA序列AvMaSp1 (GenBank登录号: AY177203)。该部分序列大小为1 408 bp, 编码区为1 288 bp, 编码氨基酸429个, 预测分子量为34.07 kDa, 典型的重复结构为 (GA)nAm(GA)N, 与十字园蛛(Araneus diadematus)丝蛋白基因ADF-1 (GenBank登录号: ADU47853)同源关系最近, 一致性为75.0%。     

大腹园蛛管状腺丝重组蛋白的克隆表达及纺丝

TuSp1蛋白(tubuliform spidroin 1)是管状腺丝(tubuliform silkfiber)的主要组成成分。管状腺丝作为蛛丝卵袋的外层包卵丝,其结构具有很好的耐腐蚀性和良好的力学性能。目前国内外对大腹园蛛TuSp1蛋白的研究很少,仅有一条基因序列的报道。本课题首次构建含大腹园蛛N端非重复结构域、重复单元以及C端非重复结构域的重组管状腺丝蛋白TuSp1 NT-Rp-CT,并经湿法纺丝获得重组蛋白丝纤维。重组蛋白液圆二色谱分析结果显示,pH由7.0降低到5.5的过程中,始终保持稳定的α-螺旋构象;重组蛋白丝纤维的傅里叶变换红外光谱结果显示,丝纤维中主要二级结构为β-折叠及β-转角;经扫描电镜观察发现,冻干的絮状重组蛋白能自组装成丝纤维,且表面光滑纤细;湿纺后的重组蛋白丝纤维直径较粗,但表面较平整均匀,具有类似天然管状腺丝的形态特征,这些为TuSp1蛋白的成丝机理及仿生纺丝研究提供了理论依据。     

重组杂合蛛丝蛋白MiSpNT-PySpRp-MiSpCT的二级结构表征

重组蛛丝纤维作为一种性能优异的生物材料,具有良好的生物相容性,在生物医学工程领域具有极大的潜在应用价值。已有研究表明,重组蛛丝蛋白可用作血管、神经导管及药物载体等,但其生物学功能仍有待研究。本研究以大腹园蛛基因组为模板,设计特异性引物,通过PCR扩增获得大腹园蛛梨状腺丝（piriform spidroin: PySp）一个完整重复区（Rp）编码序列;此Rp模块与MiSpNT/CT模块重组,构建微小型杂合蛛丝蛋白MiSpNT-PySpRp-MiSpCT,成功在大肠杆菌BL21中高效表达,借助8 mol/L尿素裂解缓冲液进行变性纯化,得到纯度较高的杂合蛛丝蛋白MiSpNT-PySpRp-MiSpCT,产量约100 mg/L。CD图谱显示,MiSpNT-PySpRp-MiSpCT蛋白质溶液主要以α-螺旋和无规卷曲形式存在,随着溶液pH值降低,部分α-螺旋向β-折叠转变;红外光谱显示,在自然成丝及冻干过程中,部分α-螺旋转化为β-折叠,符合天然蛛丝蛋白成丝过程的二级结构变化特征。本研究结果为今后获得具有天然蛛丝纤维优异性能的人工重组蛛丝纤维材料提供一种新的可能。     

不同体重肩斑银鳞蛛和大腹园蛛圆网的结构特征

对在自然条件下不同体重肩斑银鳞蛛Leucauge blanda和大腹园蛛Araneus ventricosus所织圆网的结构特征进行测量研究.结果表明:体重小于35.1 mg的肩斑银鳞蛛所织圆网的捕丝长度、捕食面面积、捕丝间距和半径丝根数均与个体体重呈显著正相关,而体重大于35.1 mg的个体中,这种关系并不显著,但其圆网的上、下部捕丝长度比与体重呈显著负相关,即圆网随个体的体重增加而表现出更强的不对称性;体重小于144.9 mg的大腹园蛛所织圆网的捕丝长度和捕食面面积均与个体体重呈显著正相关,体重小于103.8 mg的大腹园蛛所织圆网的半径丝根数与个体体重呈显著正相关,而大于这一体重分界值的个体中,这种关系同样不显著.大腹园蛛圆网的平均捕丝间距与体重未呈现出相关关系,体重大于85.4 mg的个体中,其网的上、下部捕丝长度比与体重呈显著负相关.两种蜘蛛圆网结构特征的变化及圆网结构特征与个体体重关系变化的不同体重分界值,可能反映了它们在不同生境下不同生长阶段的捕食投入与捕食策略.     

大腹园蛛次壶腹腺丝的表达

基于大腹园蛛次壶腹腺丝Minor Ampullate Spidroin全长编码基因最新报道,研究了该基因的表达。利用PCR扩增该基因重复区一段长1 348 bp的片段P1,融合his-tag标签,构建酵母表达载体,在毕赤酵母菌GS115进行表达。同时构建大肠杆菌表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,P1在两种表达系统中均可实现表达。研究结果显示:P1在GS115中的表达经优化后产量、产率有较大提高,且远高于BL21(DE3)中的表达,相应的纯化效率GS115也远高于对照BL21(DE3)的表达。研究表明酵母表达系统更适合重复度高、且富含Gly/Ala的天然蛛丝蛋白基因的表达,为表达全长天然MiSp编码序列提供前期实验基础,也为大规模蛛丝蛋白的重组表达建立了平台。     

Euprosthenops australis牵引丝蛋白的原核表达

参照GenBank收录的牵引丝蛋白编码序列,经过密码子优化,人工合成3段cDNA序列:NT、CT和4Rep,由Ⅰ型限制性内切酶BsaⅠ和BspMⅠ介导无缝拼接,分别构建4RepCT、NT4RepCT、NT8RepCT和NT12RepCT重组模块.通过改造表达载体和优化培养温度,成功提高了4RepCT的表达量(30 mg/L).另外还首次成功表达NT4RepCT和NT8RepCT重组蛋白模块,表达量分别为21 mg/L和8.5 mg/L.4RepCT表达量的提高及NT4RepCT和NT8RepCT的成功表达证实了融合标签TRX有利于提高蛛丝蛋白的表达水平,为E.australis全长牵引丝蛋白的表达奠定了基础.     

蜘蛛大壶状腺丝蛋白基因的克隆和原核表达

以悦目金蛛(Argiope amoena)丝腺SMARTRACEcDNA文库为模板进行RT-PCR,克隆了1条大壶状腺丝蛋白(major ampullate spidroin,MaSp)基因cDNA序列。该条cDNA序列编码的氨基酸序列可区分为两部分(1)富含丙氨酸的片段和富含甘氨酸的片段相间排列构成的重复氨基酸序列区,并且富含甘氨酸的片段中有脯氨酸分布;(2)约100个氨基酸残基组成的C末端非重复氨基酸序列区。把MaSp基因cDNA序列亚克隆到质粒pET28b( )中,构建原核表达质粒pET28b( )-MaSp,表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE、氨基酸组成测定和N末端氨基酸序列测定的结果表明,表达产物为重组MaSp,表达量约为40mg/L。还对C末端非重复氨基酸序列对重组MaSp在水媒介中溶解性的影响进行了探讨。     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.