青藏高原戈壁生境中一株链霉菌新种Streptomyces haixigobicum sp. nov. Qhu-G9的多相分类学鉴定及其次级代谢产物的基因组挖掘

【背景】青藏高原极端生境具有丰富的微生物资源，同时也是微生物药物的重要来源，但是大量微生物新资源尚待开发利用。【目的】对从青藏高原戈壁土壤中分离得到的一株链霉菌Qhu-G9进行多相分类鉴定及次级代谢产物生物合成潜力分析。【方法】通过16S rRNA基因扩增、测序和系统发育分析，结合形态、生理生化、细胞化学组分及基因组测序等多相分类特征，确定链霉菌Qhu-G9的分类地位。【结果】Qhu-G9与链霉菌Streptomyces dioscori A217^T和Streptomyces auranttiiacus NBRC 13017^T相似度最高，均为99.22%，结合形态观察，说明该菌是一株链霉菌。基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树显示Qhu-G9独立成支，并且其生理生化和细胞化学成分特征与最相似模式菌存在较大差异。通过基因组测序评估了与最相似模式菌的数字DNA-DNA杂交值(digital DNA-DNA hybridization,dDDH)和平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)，发现Qhu...     

链霉菌底盘细胞的开发现状及其应用

天然产物及其衍生物在现代医疗中扮演着举足轻重的角色,其生物活性多样性以及化学结构的丰富性是新药研发的源泉和动力。利用纯化学方法合成天然产物在技术和成本上有很大的困难,加上许多天然产物的原始产生菌具有培养条件苛刻、产量低下等缺点,而且大量基因簇在原始菌株中是沉默的,这使得利用合成生物学思想来指导天然产物生物合成基因簇的异源表达具有重大意义。作为抗生素、抗肿瘤活性物质、免疫抑制剂等次级代谢产物主要来源的放线菌一直是研究者们关注的焦点,特别是随着基因测序技术的飞速发展,人们发现链霉菌基因组中包含着极为丰富的天然产物生物合成基因簇资源。这意味着开发链霉菌底盘细胞作为异源表达宿主有其得天独厚的优势。本综述从底盘细胞开发的意义入手,重点阐述链霉菌底盘细胞构建的策略及现状,随后通过实例阐述了各种底盘链霉菌的实际应用。     

合成生物学时代基于非模式细菌的工业底盘细胞研究现状与展望

工业微生物底盘细胞的开发将为工业生物技术的发展提供优良的细胞工厂,有利于实现环境保护及经济可持续发展。基于合成生物学"设计-构建-测试-学习"(Design-Build-Test-Learn,DBTL)策略,对底盘细胞进行多维度的理性或半理性改造是实现"建物致知"以及"建物致用"目标的重要手段。文中简述了合成生物学DBTL策略中各步骤相关的重要技术方法;概述了部分重要模式微生物底盘细胞的策略与研究进展;重点比较介绍了工业生物技术领域具有特殊生理功能、利用一碳化合物及高效生产平台化合物的部分非模式细菌;同时也提出了实现优良、安全合成微生物细胞工厂构建与应用的策略。这些方法策略包括依靠合成生物学技术方法,综合模式与非模式微生物优势,开发应用经济、高效的高通量智能装备,建立分子组学与表型组学研究平台,推动多层次系统生物学与表型组学大数据的解析、整合、模拟与可视化,以及建立高质量的数字细胞模型和基因组优化的底盘细胞,推动高效、优良工业细胞工厂的理性设计、构建与应用。     

基因组工程在微生物细胞工厂构建中的应用进展

微生物细胞工厂是以可再生资源为原料,通过微生物细胞转化制备人类所需的能源、药物、化工原料等等,或者利用微生物治理日益恶化的环境。应用基因组工程改造目标微生物可以进一步提升其应用潜力,更好地解决当今所面临的健康、能源和环保等问题。简述了目前主要的基因组改造技术及其在构建大肠杆菌、酵母、链霉菌、枯草芽孢杆菌和乳酸菌细胞工厂中的应用研究进展。     

链霉菌基因组岛和次生代谢物合成相关的生物信息学工具及数据库

随着DNA测序技术的进步, 迄今为止已有12个链霉菌基因组被测序。面对海量组学的数据, 急需采用生物信息学方法来大规模深度挖掘这些重要微生物资源, 进而实现链霉菌资源挖掘和代谢潜力释放的深度互动。围绕链霉菌基因组比较分析中菌株特有的基因组岛和次生代谢物生物合成基因簇的识别及功能解析等两个常见问题, 本文收集了近期开发的一些常用生物信息学工具和二级数据库。以链霉菌染色体核心区和两臂的划分、天蓝色链霉菌和变铅青链霉菌基因组岛的识别、卡特利链霉菌巨型质粒的鉴别为例, 简介了这些生物信息学资源的使用方法。此外, 还简述了我们课题组进行放线菌型整合性接合元件识别和开发硫肽生物合成基因簇预测新工具的一些尝试。生物信息学工具和二级数据库在链霉菌基因组比较分析中有重要作用, 可将研究重点迅速地聚焦在某株菌的可移动遗传元件和次生代谢物生成基因簇上, 确定其对应的菌株特有表型, 及解析新型化合物生物合成和调控机理。     

合成生物学在链霉菌次级代谢产物研发中的应用

链霉菌是革兰氏阳性丝状细菌,其次级代谢产物具有抗感染、抗虫、抗肿瘤、免疫调节等生理活性,在医药、食品和农业领域具有重要应用价值。链霉菌的遗传操作技术是发现和改良新次级代谢产物的基础,近年来合成生物学的兴起为链霉菌的研发提供了全新的视角。综述了合成生物学在链霉菌次级产物生物合成基因簇克隆与组装、底盘细胞设计与改造、调节两者适配性方面的应用进展。     

链霉菌Streptomyces antibioticus NRRL 8167中Naphthgeranine A生物合成基因簇的分析鉴定

【背景】微生物来源的天然产物是小分子药物或药物先导物的重要来源。对链霉菌Streptomyces antibioticus NRRL 8167的基因组分析显示,其包含多个次级代谢产物的生物合成基因簇,具有产生多种新化合物的潜力。【目的】对链霉菌S. antibioticus NRRL 8167中次级代谢产物进行研究,以期发现结构新颖或生物活性独特的化合物,并对相应产物的生物合成基因簇和生物合成途径进行解析。【方法】利用HPLC图谱结合特征性紫外吸收和LC-MS方法,排除S. antibioticus NRRL 8167产生的已知化合物,确定具有特殊紫外吸收的化合物作为挖掘对象,然后利用正、反相硅胶柱色谱、高效液相色谱等技术对次级代谢产物进行分离纯化,分离化合物。利用质谱及核磁共振光谱技术对化合物结构进行解析和鉴定;提取链霉菌S. antibioticus NRRL 8167基因组DNA,利用PacBio测序平台进行基因组测序;利用生物信息学对基因组进行注释,并对合成该化合物的基因簇进行定位分析,推导其生物合成途径。【结果】确定这个化合物是NaphthgeranineA,属于聚酮类化合物。全基因组序列分析发现S.antibioticusNRRL8167基因组含有28个次级代谢产物生物合成基因簇,其中基因簇20可能负责Naphthgeranine A的生物合成,并对其生物合成途径进行了推导。【结论】基于紫外吸收光谱和质谱特征,从S. antibioticus NRRL 8167菌株的发酵提取物中分离鉴定了一个聚酮类化合物Naphthgeranine A。该菌株的全基因组测序为其生物合成基因簇的鉴定提供了前提,对Naphthgeranine A生物合成基因簇和生物合成途径的推测为进一步研究这个化合物的生物合成机制奠定了基础。     

微生物有机酸转运蛋白的研究进展

转运蛋白是一类膜蛋白,可介导生物膜内外化学物质的跨膜转运及信号交换。有机酸转运蛋白在微生物有机酸代谢的跨膜转运过程中发挥重要作用,根据转运蛋白有机酸转运的方向不同可以分为摄取转运蛋白和外排转运蛋白。在微生物代谢中,有些有机酸可以作为能源直接参与体内代谢,有些是能量转换过程中的重要中间产物;摄取转运蛋白的过表达,可以促进微生物细胞获取能源物质,高效的生产目标产物;有机酸摄取转运蛋白敲除或外排转运蛋白表达,有利于底盘细胞外排更多目标产物,进而促进有机酸的生物合成。研究有机酸转运蛋白的结构和功能,有助于解析微生物细胞有机酸生物合成及利用的机制,对于提高工业微生物对有机酸的利用及生物合成具有重要作用。本文综述了微生物有机酸转运蛋白分类和结构、转运方式和转运功能等方面,重点综述了转运蛋白在有机酸生产中的应用,为工业微生物有机酸的高效生物合成及未来发展提供参考。     

微生物基因组精简优化的研究进展

微生物基因组精简优化是构建合成生物学底盘细胞的重要策略.文中从基因组精简的整体设计出发,归纳了微生物的必需基因及其确定方法,重点介绍了各种微生物基因组精简策略,分析了多种基因组精简菌株的特点,充分展示了基因组精简优化在构建合成生物学底盘细胞中的重要作用.     

非常规酵母的分子遗传学及合成生物学研究进展

先进的合成生物学技术与传统的分子遗传学技术的结合更有助于实现酵母底盘细胞的快速改造和优化。酵母合成生物学研究最早开始于常规酵母——酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),近些年来又迅速扩展至一些非常规酵母,包括巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)等。借助合成生物学技术与工具,目前科学家们已经成功开发出了能够高效生产生物材料、生物燃料、生物基化学品、蛋白质制剂、食品添加剂和药物等工业产品的重组非常规酵母工程菌株。本文系统总结了合成生物学工具(主要是基因组编辑工具)、合成生物学组件(主要是启动子和终止子)和相关分子遗传学方法在上述非常规酵母系统(底盘细胞)中的最新研究进展和应用情况,并讨论了其他合成生物学技术在这些非常规酵母表达系统中的潜在适用性和应用前景。这为研究人员利用合成生物学方法在这一新型非模式微生物底盘细胞中设计和构建各种高附加值工业产品的异源合成模块并最终实现目标化合物的高效生物合成提供了科学的理论指导。     

合成生物学底盘微生物细胞的应用及其生物安全在创新型本科生培养中的实践

本科生创新能力培养是"双一流"建设人才培养的重要组成部分。合成生物学是一门新兴多学科交叉领域,被誉为可改变世界的十大新技术领域之一。构建高版本底盘微生物细胞和利用底盘细胞人工合成细胞工厂是合成生物学的重要组成部分。以实现创新型本科生为培养目标,我们将合成生物学底盘微生物细胞技术融入人才培养环节,通过组织学生参加国际遗传工程机器设计竞赛、主持大学生创新创业训练项目以及完成本科生毕业设计课题等多元化途径,提高学生理论联系实际及创新实践能力。同时,由于底盘微生物细胞是基因组经过精简、优化或其基因通路被改变的细胞,其应用存在一定的生物安全风险。我们通过将安全教育纳入培养大纲和教学计划、出版实验室安全与操作规范专业教材、开发虚拟仿真实验项目、建立实验室准入制度和信息化管理体系,以及针对底盘微生物细胞从购买、管理、规范使用和废弃物处理等进行生物安全教育等系列举措,规范底盘微生物细胞应用的生物安全。这些实践为培养创新型本科生提供了一个强有力的途径和有效保障,也为合成生物学的发展提供了支持,并有助于培养新的生力军。     

藤黄生孢链霉菌NRRL 2401遗传操作系统和基因文库的构建北大核心CSCD

【目的】建立藤黄生孢链霉菌NRRL 2401的遗传操作系统和基因文库,以便筛选次级代谢产物生物合成基因。【方法】利用大肠杆菌和链霉菌的属间接合转移的方法,以整合型载体pPM927、pSET152和复制型载体pJTU1278构建链霉菌遗传操作系统。以pCClFOS^(TM)载体,大肠杆菌EP1300^(TM)-T1~R为宿主菌构建Fosmid文库。随后,设计引物,利用"板池-行池-单克隆"的三级PCR方法对文库进行快速筛选。【结果】pPM927、pSET152和pJTU1278均成功转入藤黄生孢链霉菌NRRL 2401,其中pSET152载体的转化效率最高。构建了稳定高效的藤黄生孢链霉菌NRRL 2401的基因文库,含2880个克隆,平均插入片段大小约为35 kb,空载率小于1%,文库覆盖率为99.99%,覆盖基因组16.5倍。同时,初步筛选出可能含有吲哚霉素生物合成基因簇的9个阳性克隆。【结论】成功构建了稳定高效的藤黄生孢链霉菌NRRL 2401遗传操作系统和高质量的基因文库,为克隆该菌中次级代谢产物生物合成基因簇以及进一步遗传改造奠定了基础。     

阿维菌素的生物合成及代谢工程研究进展

阿维菌素(avermectin)是由除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)产生的一种具有杀虫活性的大环内酯类抗生素,在农业和畜牧业中应用广泛。本文综述了有关除虫链霉菌基因组序列分析、阿维菌素的生物合成以及阿维菌素育种和代谢工程的研究进展。     

链霉菌次级代谢调控相关的双组分系统研究进展

链霉菌具有强大的次级代谢能力, 能够产生众多具有生物活性的次级代谢产物, 如目前广泛应用的抗生素、抗肿瘤药物以及免疫抑制剂等。在链霉菌中, 次级代谢产物的生物合成受到包括途径特异性、多效性以及全局性调控基因在内的多层次严格调控。关键调控基因的缺失或过表达可以显著影响次级代谢产物的生物合成, 提示对于链霉菌次级代谢重要调控基因的功能及其作用机制的研究具有巨大的潜在应用价值。其中, 作为细菌信号传导系统的双组分系统(Two-component system, TCS)一直是大家研究的关注点。越来越多的研究表明TCS在链霉菌次级代谢过程中发挥着全局性的调控功能。本文重点介绍链霉菌模式菌株——天蓝色链霉菌中TCS(包括典型TCS)、孤立的组氨酸蛋白激酶(HK)以及应答调控蛋白(RR)参与次级代谢调控的研究进展。这些TCS的功能鉴定及机制解析为工业链霉菌的定向遗传改造以提高重要次级代谢产物的含量提供了理论依据。     

酿酒酵母中胆固醇生物合成与优化的研究进展

胆固醇是动物体内积累的主要甾醇化合物,在维持细胞膜功能、合成甾体激素、生产甾体药物中间体等方面具有重要的生物学意义和医学应用价值。传统动物组织提取胆固醇的方法费时费力并存在严重的环境污染问题,而甾醇分子结构的复杂程度也限制了其化学全合成。近些年,人们利用合成生物学方法构建的微生物细胞工厂已成功用于萜类、甾醇类等天然产物的开发与合成。文中综述了胆固醇微生物细胞工厂的研究进展,包括胆固醇生物合成途径的解析、底盘菌株的选择、异源基因元件的挖掘与优化、相关代谢通路的调控等方面,并讨论了当前研究面临的问题,以期为胆固醇的高效生物合成提供参考。     

基因组信息指导的星海链霉菌中2-甲硫基-N6-(4-羟基异戊烯基)-腺苷的分离鉴定

【目的】研究海洋链霉菌新种星海链霉菌Streptomyces xinghaiensis NRRL B24674~T次级代谢物中是否存在2-甲硫基-N~6-异戊烯基修饰的腺苷。【方法】通过生物信息学分析星海链霉菌S.xinghaiensis NRRL B24674~T基因组序列,寻找这类化合物的生物合成相关基因;采用正相硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、凝胶柱色谱和高效液相色谱等分离技术对该菌株的发酵粗提物进行分离纯化;利用质谱与核磁共振等波谱技术鉴定化合物的结构。【结果】在星海链霉菌基因组中找到含有2-甲硫基-N~6-异戊烯基修饰的化合物生物合成途径中的2个同源蛋白;从该菌的发酵液中分离鉴定了2-甲硫基-N~6-(4-羟基异戊烯基)-腺苷(ms2io6A)。【结论】星海链霉菌S.xinghaiensis NRRL B24674~T存在此类腺苷修饰反应,并且是首次在链霉菌中发现此类腺苷修饰。生物信息学分析预示着链霉菌中可能普遍存在此类核酸或者核苷修饰。     

灰色链霉菌胰蛋白酶在变铅青链霉菌中的异源表达及酶学性质分析

胰蛋白酶作为一种重要的丝氨酸蛋白酶被广泛应用于食品、医药和皮革等工业领域.本文成功实现了灰色链霉菌来源的胰蛋白编码基因在变铅青链霉菌中的高效活性表达,并对其酶学性质进行分析比较.以灰色链霉菌ATCC10137基因组为模板,获得胰蛋白酶编码基因sprT并克隆至表达质粒pIJ86,成功构建了重组链霉菌工程菌TK24/pIJ86-sprT.以R2YE和SELF为发酵培养基,最高酶活分别达9.21 U/mL和8.61 U/mL.酶学性质分析表明,和牛胰蛋白酶(BT)相比,重组链霉菌胰蛋白酶(rSGT)的耐酸能力强,具有较广的pH;且rSGT对酰胺键具有更高的特异性;此外,Zn2+和有机溶剂分别对rSGT的酯酶活力和酰胺酶活力具有促进作用;本研究结果为rSGT的性质改造以及工业应用提供了依据.     

放线菌基因组与生物技术

天蓝色链霉菌全基因组序列的公布 ,对目前工业生产生物活性代谢产物菌株的遗传改造 ,构建生产高价值药物的超级菌 ,以及由微生物资源去寻找新的生物活性代谢产物将产生巨大影响。文中就基因组时代如何发展由基因组信息和化合物库预测次生代谢路径、研究功能基因组学时代的放线菌次生代谢调控、基因工程技术在放线菌抗生素生产中的应用以及体外分子定向进化与分子育种等生物技术问题进行文献综述。     

链霉菌启动子及其应用研究进展

链霉菌天然产物因其显著的生物活性一直是新药开发的重要来源,测序技术的发展揭示了链霉菌强大的生物合成潜力。链霉菌中多数次级代谢生物合成基因簇(biosynthetic geneclusters,BGCs)在常规实验条件下表达水平低甚至不表达,这使得相关天然产物的开发受到阻碍。原位激活和异源表达是挖掘链霉菌天然产物的有效方式,启动子作为基因表达的“开关”,在其中发挥着重要作用。因此对启动子的研究可以有效地促进BGCs的激活,从而挖掘新天然产物。本文重点阐述了链霉菌启动子的结构特征及其挖掘表征和设计构建的思路,并列举了链霉菌启动子在天然产物开发中的应用,有望为链霉菌生物合成路径的优化以及全新生物活性物质的发现提供思路和方法学参考。     

淀粉酶链霉菌BAC基因组文库的构建及鉴定

提取淀粉酶链霉菌SM33基因组DNA,用Hind III部分酶解后回收40 kb～60 kb大小的高分子量DNA,与质粒载体pIndigoBAC536连接,电击转化EPI300感受态细胞,经蓝白斑筛选共挑取了5 184个白色克隆.从文库中随机挑选10个克隆,酶切检测平均插入片段约为50 kb,覆盖了32.4倍基因组.并且插入片段均具有9～15个Not I酶切位点,符合链霉菌基因组特征.通过对BAC文库的筛选,获得苹果酸脱氢酶基因(mdh)的保守序列,与已知的链霉菌mdh具有很高的相似性.淀粉酶链霉菌BAC基因组文库的建立,对基因克隆、基因组物理图谱、次级代谢途径、新抗生素的发现以及工业用酶的应用等研究均有重要意义.