酚氧化酶及其酶原的生化特性与分子生物学研究进展

酚氧化酶(简称PO),又称为酪氨酸酶(tyrosinase,EC1.14.18.1),是一种含铜的酶.它能够分别催化单酚羟基和二羟基酚氧化成二酚(如多巴)和醌,醌在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素.PO在脊椎动物和无脊椎动物中都广泛存在,被认为是一种参与免疫的重要因子.本文就酚氧化酶及其酶原的生化特性和分子生物学特性研究的进展情况予以综述.     

注射亲水性硅珠对棉铃虫血浆酚氧化酶活性的影响

昆虫通过细胞免疫和体液免疫的协同作用对入侵的异物做出防御反应。在不同时间向棉铃虫体内注射亲水性硅珠后,测定了血浆中酚氧化酶（PO）的活性,同时研究了不同抑制剂和激活剂对注射硅珠后的酚氧化酶活性的影响。结果表明,注射亲水性硅珠后,棉铃虫血浆中酚氧化酶的活性明显升高。分别以牛胰蛋白酶和昆布多糖作为酚氧化酶原（proPO）的激活剂,发现两者都可激活注射硅珠后血浆中的proPO。以牛胰蛋白酶激活时,随着注射硅珠后时间的延长,PO活性逐渐增高;而用昆布多糖激活后PO活性也明显升高,但注射硅珠后不同时间proPO被昆布多糖激活的情况基本相似。这些结果表明,在异物入侵后酚氧化酶原有很大程度的积累,并能被激活,协同细胞免疫抵御异物入侵。P-NPGB和PTU几乎能完全抑制酚氧化酶的活性。     

昆虫酚氧化酶原激活酶研究

昆虫酚氧化酶原激活酶(Prophenoloxidase activating proteinase,PAP)是酚氧化酶原激活过程中的一个关键酶,是昆虫先天性体液免疫体系的重要组成部分。外界的免疫刺激能够诱导级联反应上游的蛋白对酚氧化酶原激活酶的前体进行剪切激活,而激活后的酚氧化酶原激活酶能够将无活性的酚氧化酶原剪切激活为有活性的酚氧化酶并最终生成细胞毒素物质来消灭外源物。本文综述了昆虫酚氧化酶原激活酶的结构与特性及其在酚氧化酶原级联激活系统中的作用机制,并探讨了寄生蜂对寄主昆虫酚氧化酶原激活酶的调控。     

中国对虾（Penaeus chinensis）酚氧化酶的分离纯化及其部分生物化学性质

以中国对虾 (Penaeuschinensis)的血淋巴为材料 ,利用凝胶过滤和离子交换等方法 ,对酚氧化酶 (phe noloxidase ,E .C .1 .1 0 .3.1 )进行了分离纯化和生物化学性质研究。实验发现 ,酚氧化酶原 (prophenoloxidase)的分子量为 87.5kD左右 ,在实验操作过程中极易发生降解或自身降解 ,变成有活性的大小约 77kD的酚氧化酶 ,1 0g/LSDS可使该酶原全部被激活而成为有活性的酚氧化酶。以L 二羟苯丙氨酸 (L DOPA)为特异性底物对酚氧化酶活性进行研究发现 ,其最适pH值为 6 .0左右 ,最适温度为 4 0℃ ,Km 值约为 1 .99mmol/L。利用多种氧化酶抑制剂对酚氧化酶纯化样品的酶活性进行研究 ,发现抗坏血酸 (ascorbicacid)、半胱氨酸 (cysteine)和二硫苏糖醇(dithiothreitol)对酚氧化酶活性具有很强的抑制作用 ,硫脲 (thiourea)对酚氧化酶活性也具有较强的抑制作用 ,而酚氧化酶对苯甲酸 (benzoicacid)、柠檬酸 (citricacid)和亚硫酸钠 (sodiumsulfite)不敏感 ,而且该酶对酪氨酸等单酚还具有高特异性的酚氧化酶活性 ,表明它可能是一种酪氨酸酶型的酚氧化酶 ;此外 ,该酶对EDTA和金属离子非常敏感 ,其活性能被Cu2 强烈抑制 ,被Mg2 强烈激活 ,表明该酶很可能是一种金属酶 (metalloenzyme)     

软体动物和甲壳动物酚氧化酶的研究进展

软体动物和甲壳动物的很多品种都是重要的经济养殖品种.随着养殖业集约化程度的提高,各种病害频繁发生,造成了巨大的经济损失.于是越来越多的人开始关注软体动物和甲壳动物的免疫防御系统,并对其进行研究.酚氧化酶(phenoloxidase,PO)是一种含铜的氧化酶,广泛存在于微生物、动物和植物体内.作为酚氧化酶原激活系统的重要一员,PO在无脊椎动物的先天免疫机制中起着重要的作用,有关其生物化学、免疫学和分子生物学特性的研究一直以来受到广泛关注,尤其在节肢动物中进展很快.作者对酚氧化酶在软体和甲壳动物中的功能、组织定位及表达、基因克隆和序列分析及其系统演化等几个方面的研究进展进行了综述.基因序列分析和系统进化树证据均表明,催化功能相同的软体动物酪氨酸酶与节肢动物PO的基因有较大差异.该结果对目前被广泛接受并使用的酪氨酸酶专门用于哺乳类,酚氧化酶专门用于无脊椎动物的分类法提出了挑战.因此作者建议,将酚氧化酶专门用于节肢动物,酪氨酸酶用于软体动物等非节肢动物和脊椎动物.     

昆虫酚氧化酶原活化及其在免疫中的作用

1　前言酚氧化酶 (phenoloxidase,PO)以无活性的酶原形式——酚氧化酶原 (prophenoloxi-dase,PPO)存在于昆虫血淋巴、中肠和表皮等组织 ,当病原生物入侵时 ,通过特异性丝氨酸蛋白酶的级联反应 (PPO级联 )被活化 ,参与机体的免疫防御反应 [1] 。本文拟就近年来有关昆虫PPO级联及其在免疫中的作用等研究方面的新进展做一简述。2　PPO的特性及其分子生物学PPO是 PPO级联中一个很重要的成分 ,近年来 ,随着分子生物学技术和其他相关学科的快速发展及向昆虫学领域的日渐渗透 ,有关PPO特性及其分子生物学方面的研究取得了很大进展。目前…     

四种杀菌剂对玉米螟赤眼蜂酚氧化酶活性的影响

为明确杀菌剂对玉米螟赤眼蜂Trichogramma ostriniae Pang et Chen毒性大小及其成蜂体内酚氧化酶（phenoloxidase, PO）活性影响, 本实验通过测定三唑酮（triadimefon）、 肟菌脂（trifloxystrobin）、 咪鲜胺（prochloraz）、 申嗪霉素（phenazino-1-carboxylic acid）4种杀菌剂对玉米螟赤眼蜂的急性毒性, 并分别测定活体和离体条件下各杀菌剂处理后酚氧化酶的比活性。结果表明, 各药剂对赤眼蜂的急性毒性大小为： 三唑酮＞咪鲜胺＞肟菌酯＞申嗪霉素, 其LC₅₀值分别为3.27, 6.46, 4.06和 9.72 mg/L, 其安全系数依次为0.07, 0.10, 0.20和1.47, 其中申嗪霉素为中等风险性, 其余3种药剂为高风险性, 且杀菌剂明显激活了PO的活性。活体条件下亚致死剂量处理得到的PO比活力高于离体处理, 且三唑酮处理组具有明显的剂量效应。本实验为研究杀菌剂对赤眼蜂的毒性及对PO的影响作了初步的探索, 为进一步研究赤眼蜂对杀菌剂的抗性及免疫能力奠定基础。     

棉铃虫不同虫态及虫龄血淋巴中酚氧化酶活力的比较

分别测定了棉铃虫Helicoverpa armigeraHübner不同虫态及虫龄血清和血细胞中酚氧化酶(phenoloxidase,PO)的活力。结果显示血清和血细胞中都有酚氧化酶活性,且血细胞中高于血清中。不同虫态及虫龄的血清和血细胞中酚氧化酶活力有很大的不同,血清和血细胞中酚氧化酶活力变化规律一致。3龄幼虫酶活力最高,5龄幼虫最低。酶活力大小依次为:3龄幼虫>预蛹>4龄幼虫>蛹>5龄幼虫     

几种化学因子对三种赤眼蜂离体酚氧化酶活性的影响

为比较不同赤眼蜂酚氧化酶（PO）活性的大小, 明确赤眼蜂种间免疫防御能力强弱, 本研究通过研磨、离心提取松毛虫赤眼蜂Trichogramma dendrolimi、螟黄赤眼蜂T. chilonis、玉米螟赤眼蜂T. ostriniae匀浆液, 首次测定了几种化学因子（Ca²⁺、昆布多糖、纤维素、右旋糖酐、脂多糖和丝氨酸蛋白酶抑制剂）对3种供试赤眼蜂匀浆液中酚氧化酶原激活系统（proPO-AS）的激活程度。结果表明: 玉米螟赤眼蜂匀浆液PO活性最高, 螟黄赤眼蜂次之, 松毛虫赤眼蜂最低。Ca²⁺是激活供试赤眼蜂proPO的必需因子, 且在0.03 mol/L浓度下激活作用最强; 昆布多糖和脂多糖也能有效激活proPO, 0.01及0.05 mg/mL昆布多糖能强烈激活PO活性; 纤维素和右旋糖酐对PO活性存在显著抑制作用。结果证明了赤眼蜂种间存在明显的免疫能力差异。本研究建立了小型昆虫proPO-AS研究体系, 为研究Wolbachia-小型昆虫的免疫互作体系奠定了基础。     

植物多酚氧化酶的研究进展

多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)是一类普遍存在于植物、真菌和昆虫质体中,由核基因编码, 能与铜相结合的金属蛋白酶。它能分别催化单酚羟基和二羟基酚氧化为O-二酚和O-醌。植物多酚氧化酶是许多果蔬等农产品酶促褐变的主要原因, 同时它在植物的光合作用、抗病虫害、生长发育以及花色的形成中起一定作用。本文综述了植物多酚氧化酶在细胞学、分子遗传学及其生产应用等方面的研究进展。     

植物多酚氧化酶的研究进展

多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是一类普遍存在于植物、真菌和昆虫质体中,由核基因编码,能与铜相结合的金属蛋白酶.它能分别催化单酚羟基和二羟基酚氧化为O-二酚和O-醌.植物多酚氧化酶是许多果蔬等农产品酶促褐变的主要原因,同时它在植物的光合作用、抗病虫害、生长发育以及花色的形成中起一定作用.本文综述了植物多酚氧化酶在细胞学、分子遗传学及其生产应用等方面的研究进展.     

昆虫体液免疫的分子生物学

昆虫是一类分布非常广泛的动物,在生态系统中占有重要地位。昆虫在长期的进化过程中,形成了自己独特的免疫系统。本文对昆虫体液免疫中三种重要的因子：抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)、酚氧化酶(phenoloxidase,PO)和溶菌酶(lysozyme)在分子生物学方面的进展作了一综述,并对抗菌肽和酚氧化酶的作用方式及机理做了一概述。     

亚洲玉米螟酚氧化酶原的原核表达和性质分析

【目的】昆虫体内酚氧化酶原（PPO）是一种重要的天然免疫蛋白,参与昆虫的体液免疫和细胞免疫过程。本研究采用原核表达体系,大量表达可溶且具有活性的重组PPO蛋白,可用于各种酚氧化酶（PO）抑制剂的筛选,从而为创制抑制昆虫免疫系统的新型杀虫剂提供条件。【方法】利用从亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis 5龄幼虫体内克隆获得PPO基因,构建了pET-28b-PPO原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli中重组表达了亚洲玉米螟PPO蛋白;采用Ni-NAT亲和层析柱快速纯化目的蛋白,进行了Western杂交鉴定;测定分析了重组PPO蛋白激活为PO后的酶学性质以及不同金属离子（Mg²⁺,Cu²⁺和Fe²⁺）对PPO二级结构的影响。【结果】融合蛋白PPO得到了表达和纯化。重组PPO蛋白激活为PO后最适反应温度为30℃,最适pH为7.2,以L-DOPA为底物时PO催化反应的V_max为140.8 U/mg·min,Km为2.96 mmol/L。Fe²⁺存在的情况下重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著增加至53.7%±4.6%,α-螺旋结构成分则显著下降至2.6%±1.2%（P<0.05）;有Mg2+存在的情况下,重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著下降,α-螺旋结构成分稍有上升。有Cu²⁺存在的情况下,重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著下降为10.0%±1.6%,而α-螺旋结构成分则上升至35.3%±6.9%。【结论】结果说明不同金属离子对重组PPO蛋白的二级结构有显著影响。     

紫外分光光度计法与酶标仪微量法测定酚氧化酶蛋白含量及活力的比较

分别采用紫外分光光度计比色法与酶标仪微量法测定菜青虫Pieris rapae(L.)体内酚氧化酶蛋白含量和活力,以水杨醛缩对硝基苯胺为抑制剂,对2种方法的结果进行比较。结果表明,微量法和比色法在检测酚氧化酶(PO)蛋白含量、酶活力和抑制剂对PO抑制作用时结果无显著性差异。因此,微量法可以替代比色法,使用试剂量大大降低,重复性好,操作简单、快捷。     

玫烟色棒束孢侵染对小菜蛾幼虫体内不同酶活的影响

在实验室条件下,测定了昆虫病原真菌玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea的侵染对小菜蛾Plutella xylostella3龄幼虫体内酚氧化酶(PO)和不同抗氧化酶类,包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢(CAT)及谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)活力的变化。结果表明,玫烟色棒束孢侵染小菜蛾3龄幼虫后,体内PO、SOD、POD、CAT和GSTs活力均受到明显的影响。其中感病小菜蛾幼虫体内的PO活力始终高于同期未感染的小菜蛾幼虫,当接菌40h时,酚氧化酶活力达到最大37.4U/g,为对照的2.6倍,而SOD、POD、CAT和GSTs活力在感病前期明显高于对照,接菌40–48h各种酶活力均达到最大,当接菌56h酶活力开始下降,64h时酶活力均明显低于对照。可见玫烟色棒束孢的侵染严重干扰了小菜蛾幼虫体内正常的生理活动。     

酚氧化酶参与德国小蠊对大肠杆菌的免疫应答

【目的】探讨酚氧化酶(phenoloxidase, PO)在德国小蠊Blattella germanica对大肠杆菌Escherichia coli的免疫响应中的作用。【方法】利用同源克隆和RACE方法获得德国小蠊酚氧化酶基因（BgPO）的全长cDNA序列,用MEGA5.1软件构建BgPO与其他昆虫PO的系统进化树,用RT-PCR方法检测BgPO的组织表达模式及大肠杆菌诱导后不同时间的表达量变化,用Hultmark 方法测定抑菌活力,用邻苯二酚法测定酚氧化酶活性。【结果】获得的德国小蠊BgPO基因（GenBank登录号：KJ789157）cDNA全长为2 252 bp,其中开放阅读框大小为2 085 bp,编码695个氨基酸,预测的分子量和等电点分别为79.7 kDa和6.19。Blast分析结果表明德国小蠊BgPO与其他昆虫PO有较高的同源性,其中与白蚁Coptotermes formosanus PO的氨基酸序列一致性高达80%;系统进化树分析显示其与C. formosanus PO的亲缘关系最近。基因表达检测结果表明BgPO主要在血淋巴细胞和表皮中表达。大肠杆菌诱导德国小蠊后,发现BgPO的表达量在诱导24 h后升高,在诱导后36 h达到峰值;其血淋巴的抑菌活力及酚氧化酶的活性在诱导后6-36 h内均随着诱导时间的增加而增加,且菌诱导组与PBS诱导组之间存在显著差异(P<0.05)。【结论】本研究获得的德国小蠊酚氧化酶基因BgPO主要在血淋巴和表皮中表达,并参与了大肠杆菌诱导的免疫应答反应。研究结果为进一步探索酚氧化酶在德国小蠊对病原菌的免疫响应机制奠定基础。     

单宁酸对甜菜夜蛾幼虫生长发育及酚氧化酶活性的抑制作用

采用摄食毒力法研究了单宁酸对甜菜夜蛾[Spodoptera exigua (Hübner)]幼虫生长发育的影响及毒力作用,并分析了单宁酸对甜菜夜蛾酚氧化酶的抑制动力学.结果表明,不同质量浓度单宁酸对甜菜夜蛾初孵幼虫具有较强的毒杀作用,对3龄幼虫的体质量以及蛹质量、化蛹及羽化过程也均有明显的抑制作用(P<0.05).随单宁酸质量浓度的提高或处理时间的延长,甜菜夜蛾初孵幼虫的校正死亡率逐渐增大,单宁酸的抑制生长效应逐渐增强,处理第7天,单宁酸对试虫的半致死浓度(LC50)为3.772 3 g·L-1;8 g·L-1单宁酸对3龄幼虫体质量增长的抑制率最高(35.09%);16 g·L-1单宁酸对蛹质量和羽化率的影响最明显.单宁酸能明显抑制甜菜夜蛾酚氧化酶的活力,且随单宁酸浓度的提高,酚氧化酶相对活力下降趋势明显趋缓,单宁酸对甜菜夜蛾酚氧化酶活性的半抑制浓度(IC50)为0.234 3 mmol·L-1;在加入不同浓度单宁酸的反应体系中,酚氧化酶的活力与酶液量呈明显的线性关系;不同浓度单宁酸对甜菜夜蛾酚氧化酶抑制作用的Lineweaver-Burk双倒数图为1组横轴截距不变的直线;另外,单宁酸和半胱氨酸均可将多巴醌还原为多巴,且还原量均随反应时间的延长而增加.研究结果说明,单宁酸对甜菜夜蛾酚氧化酶的抑制作用是可逆的,为典型的非竞争性抑制剂,抑制常数(Ki)为0.193 8 mmol·L-1;单宁酸对甜菜夜蛾酚氧化酶二酚酶的抑制作用与L-多巴氧化产物的还原有关.     

褐飞虱和桃蚜粗提液中酚氧化酶原激活系统的激活特点

采用研磨法制备褐飞虱Nilaparvata lugens (Stål)和桃蚜Myzus persicae (Sulzer)粗提液,用于研究几种化学因子对粗提液中酚氧化酶原激活系统(proPO-AS)的激活特点。结果表明, 在0.1～100 mmol/L的Ca²⁺浓度范围内,虱液和蚜液的酚氧化酶(PO)活性随Ca²⁺浓度升高而增强,并在30 mmol/L处PO活性达到最高,在此限之上PO活性反而下降。当昆布多糖浓度从10^-4 mg/mL升至10 mg/mL时,虱液和蚜液的PO活性也随之升高,但再提高昆布多糖浓度却未见PO活性的峰顶出现。在6种葡聚糖对PO的激活作用中,昆布多糖和酵母聚糖能显著增强PO活性,但curdlan对虱液和蚜液的PO无明显激活作用,而甘露聚糖、右旋糖苷和纤维素则降低PO活性。这些结果显示β-1,3-葡聚糖能有效激活proPO-AS。Ca²⁺和丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF加样顺序的不同也会影响PO活性。     

淡足侧沟茧蜂寄生对草地贪夜蛾幼虫血淋巴黑化反应及酚氧化酶的影响

【目的】明确淡足侧沟茧蜂Microplitis pallidipes寄生对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda血淋巴黑化率、酚氧化酶原（Prophenoloxidase,PPO）基因表达量和酚氧化酶（Phenoloxidase,PO）活性的影响,为更有效的利用淡足侧沟茧蜂防控草地贪夜蛾提供理论依据。【方法】通过室内寄生实验确定草地贪夜蛾被淡足侧沟茧蜂寄生的最佳龄期;通过RT-qPCR分析草地贪夜蛾两个PPO基因（SfPPO1和SfPPO2）的时空表达谱;通过薄膜法统计草地贪夜蛾被寄生后的血淋巴黑化率;采用吸光光度法测定草地贪夜蛾被寄生后的血淋巴PO活性;采用RT-qPCR测定草地贪夜蛾被寄生后血淋巴SfPPO1和SfPPO2的相对基因表达量。【结果】草地贪夜蛾被淡足侧沟茧蜂寄生的最佳龄期为3龄幼虫,SfPPO1和SfPPO2均在卵块和4龄幼虫中基因表达量较高,且主要在幼虫血淋巴中表达。草地贪夜蛾被寄生后12、24、48和72 h的血淋巴黑化率显著低于未寄生组（P<0.05）,SfPPO1和SfPPO2的相对基因表达量和PO活性也低于未寄生组。相关关系分析表明,SfPPO1的相对基因表达量与SfPPO2的表达量呈现线性关系（R2=0.9124）,PO活性与两个PPO基因相对表达量之间、黑化率与PO活性和PPO基因相对表达量之间均呈现正相关。【结论】淡足侧沟茧蜂寄生会抑制草地贪夜蛾血淋巴的黑化率,下调血淋巴中酚氧化酶原基因的表达量和PO活性,且PO活性、PPO基因相对表达量及血淋巴黑化率3个指标之中,两两之间均呈现正相关性。     

槲皮素对黄粉虫血淋巴酚氧化酶的生理效应

用酶标仪法测定了槲皮素对黄粉虫Tenebrio molitor酚氧化酶（phenoloxidase, PO）的生物活性。结果表明：在离体条件下,对黄粉虫血淋巴PO的IC₅₀为0.625 mmol/L。在活体情况下,当槲皮素-DMSO溶液或槲皮素水悬浮液（5 μL）注入虫体后,在浓度低于1.0 mmol/L时对黄粉虫血淋巴PO具有激活作用,当浓度高于2.0 mmol/L时则对PO具有明显的抑制作用;单独注射5 μL DMSO溶液对PO活性亦有一定的激活作用。试虫被注射槲皮素后,PO活性在2～4 h内迅速下降,然后缓慢上升,处理8 h左右达到最高点,其后低浓度处理PO活性保持不变,而高浓度处理则逐渐下降,提示低浓度槲皮素可以引起试虫的免疫反应。在PO测活体系中加入0.5％的BSA后对PO活性无影响,并能使槲皮素在测活体系中保持稳定。