结核分枝杆菌Rv1886c的原核表达及其免疫生物学特性

【目的】Rv1886c基因编码的Ag85B是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)感染早期的分泌蛋白,本研究对其所诱导的免疫应答特性进行了探索。【方法】对Ag85B进行原核表达和鉴定,并通过夹心ELISA、间接ELISA及ELISPOT方法测定其诱导的细胞免疫和体液免疫应答水平。【结果】SDS-PAGE及Western blot鉴定结果表明,以包涵体形式表达的Ag85B蛋白,经变性、复性后能与结核病人的抗血清及免疫重组李斯特菌LM-Ag85B的小鼠抗血清发生特异性反应,表明His-Ag85B融合蛋白具有较好的免疫活性。将纯化的Ag85B蛋白皮下免疫C57BL/6小鼠,夹心ELISA的测定结果表明,Ag85B蛋白免疫组诱导小鼠产生的特异性IFN-γ水平显著高于IL-4的水平(P0.001),呈现Th1型细胞免疫应答趋势;以结核菌素PPD作为包被抗原,通过间接ELISA测定的血清抗体效价达到1∶6400,表明Ag85B也能诱导有效的体液免疫应答。此外,以尾静脉途径初次免疫小鼠42天时,ELISPOT测定结果显示,结核分枝杆菌H37Rv诱导小鼠产生Ag85B240-259特异性的IFN-γ水平极显著高于卡介苗(BCG)免疫组(P0.001)。【结论】Ag85B蛋白能激发小鼠产生较强的Th1型细胞免疫应答和较好的体液免疫应答;BCG单次免疫后诱导小鼠产生的Ag85B特异的细胞免疫应答水平较低。本研究为揭示结核分枝杆菌的致病机理、新型疫苗的研制和早期诊断试剂的开发奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv2628蛋白的免疫生物学特性

Rv2628蛋白是结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis(M.tb)DosR调控的潜伏感染相关抗原。本研究对Rv2628蛋白进行了原核表达和纯化,并以巨噬细胞系和小鼠为研究模型,对其免疫生物学特性进行了分析。SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明,Rv2628-His融合蛋白以包涵体形式表达,能与兔抗H37Rv多抗血清发生特异性反应,具有较好的免疫反应性。与巨噬细胞系RAW264.7的互作实验结果表明,在1–12 h内Rv2628蛋白能诱导前炎性因子IL-6的上调表达。将纯化的Rv2628融合蛋白皮下免疫BALB/c小鼠,夹心ELISA的测定结果表明,Rv2628蛋白免疫组诱导产生的特异性IFN-γ水平显著高于IL-4的水平(P0.000 1),呈现Th1型细胞免疫应答趋势;以Rv262811-30多肽作为包被抗原,通过间接ELISA测定的血清抗体效价能达到11 600,表明Rv2628也能诱导体液免疫应答。总之,Rv2628能促进巨噬细胞炎症反应的发生,激发小鼠产生强烈的Th1型细胞免疫应答和较好的体液免疫应答,具有作为亚单位疫苗的潜力,为M.tb与宿主之间的相互作用奠定了一定的理论基础。     

用小鼠模型分析可溶性表达结核分枝杆菌Ag85A的免疫原性

【目的】可溶性表达结核分枝杆菌Ag85A蛋白,并评价其免疫原性。【方法】利用冷休克表达质粒和含有伴侣质粒的大肠杆菌对Ag85A蛋白进行可溶性原核表达,并进行纯化与鉴定,通过C57BL/6小鼠模型对Ag85A蛋白的免疫原性,包括诱导机体特异性体液免疫应答和细胞免疫应答水平进行分析。【结果】重组菌诱导后裂解上清中检测到可溶性Ag85A蛋白的表达,经过亲和层析纯化收获了纯度在90%以上的Ag85A蛋白,Western blot鉴定显示其具有较好的免疫反应性。Ag85A蛋白免疫小鼠后,血清中可以检测到高水平的Ig G抗体效价,其中Ig G2b水平要高于Ig G1。通过特异性多肽、蛋白刺激脾脏和腹股沟淋巴结细胞可分泌高水平的IFN-γ、TNF-α等Th1型细胞因子。【结论】实现了Ag85A蛋白的可溶性表达,免疫特性评价显示Ag85A蛋白可诱导机体产生强烈的特异性体液免疫应答及Th1型的细胞免疫应答,从而为其进一步免疫学功能的研究奠定了重要基础。     

结核分枝杆菌海藻糖磷酸磷酸酶诱导小鼠体液和细胞免疫应答

目的 研究结核分枝杆菌(M．tuberculosis)海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)诱导小鼠体液和细胞免疫。方法 差速离心分离结核分枝杆菌H37Rv和卡介苗(BCG)的各细胞组分,通过Western杂交检测抗原TPP在结核分枝杆菌H37Rv和BCG中的亚细胞定位情况。分别用5×10~6CFU的BCG和50μg的TPP蛋白免疫C57BL/6小鼠,检测小鼠血清中抗TPP的IgG1和IgG2a抗体效价。取免疫小鼠的脾细胞,体外抗原刺激,用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测γ干扰素(IFN-γ)分泌细胞。结果 TPP亚细胞定位于结核分枝杆菌H37Rv和BCG的胞壁和细胞膜组分。TPP蛋白免疫后小鼠产生的TPP特异性IgG1和IgG2a抗体效价明显高于BCG免疫小鼠,并且IgG2a的抗体效价高于IgG1。体外抗原刺激TPP蛋白和BCG免疫小鼠的脾细胞,都能诱导较高的IFN-γ分泌。结论 结核分枝杆菌细胞壁蛋白TPP能诱导小鼠Ⅰ型辅助性T细胞介导的免疫反应,可作为抗结核疫苗的候选抗原。     

用小鼠模型分析表达牛结核分枝杆菌Ag85B重组腺病毒的细胞免疫特性

【目的】构建表达牛结核分枝杆菌抗原Ag85B重组腺病毒rAd-Ag85B,并用小鼠模型分析其细胞免疫特点。【方法】采用PCR方法,扩增结核分枝杆菌Ag85B的编码基因fbpB,测序后构建pDC516-Ag85B重组质粒。利用脂质体将pDC516-Ag85B与pBHGfrtΔE1,3FLP共转染Ad293细胞包装成重组病毒rAd-Ag85B。空斑纯化后用电镜负染、目的基因转录和蛋白表达进行rAd-Ag85B验证。同时将rAd-Ag85B和rAd(wtAd)分别经皮下注射免疫BALB/c小鼠,二免二周后取小鼠脾脏细胞,进行CD69表面分子表达、淋巴细胞增殖和ELISPOT实验分析。【结果】在电镜下能观察到包装的重组病毒粒子,且在转录和蛋白水平上验证了rAd-Ag85B构建成功。免疫试验结果显示,rAd-Ag85B能激活CD4+T和CD8+T细胞表面分子CD69的表达,并引起淋巴细胞增殖。ELISPOT表明rAd-Ag85B呈现Th1免疫特点。【结论】成功构建的rAd-Ag85B能引起机体针对PPD蛋白或Ag85B多肽的Th1免疫应答。     

结核分枝杆菌MPT83的免疫原性及其奶牛结核病血清学检测方法的建立

【目的】利用大肠杆菌系统表达并纯化结核分枝杆菌MPT83蛋白,通过小鼠模型评价其免疫原性,建立血清学间接ELISA方法用于牛结核病临床检测,评价其应用潜能。【方法】构建p ET30a(+)-mpt83重组质粒,转化BL21(DE3)诱导表达并纯化,经细胞表面分子的流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)分析、ELISPOT试验等分析其在小鼠中的免疫原性,建立间接ELISA方法,检测临床奶牛血样,评价其用于牛结核病血清学检测的潜能。【结果】SDS-PAGE显示目的蛋白成功表达,Western blot证实其对兔抗H37Rv多抗血清具有良好免疫反应性;FCM结果显示其下调树突状细胞表面CD80分子的表达,上调小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞表面CD69的表达,ELISPOT结果表明其诱导的特异性IL-4分泌细胞数显著高于IFN-γ分泌细胞数,表现为Th2型免疫应答;建立了ELISA方法,检测临床奶牛血样200份,与牛结核外周血γ-干扰素体外释放试验结果的阳性符合率和阴性符合率分别为48.6%和90%。【结论】在大肠杆菌系统中高效可溶性表达MPT83蛋白,其在小鼠模型中主要呈现Th2型免疫应答,并以该蛋白为抗原建立了牛结核病血清学检测的间接ELISA方法。     

针对潜伏结核感染的 A39 DNA 疫苗构建及其免疫原性研究

选取结核分枝杆菌潜伏相关抗原Rv2029c、结核分枝杆菌优秀抗原Ag85A和Rv3425,构建针对潜伏感染的结核分枝杆菌DNA疫苗pVAX1／Ag85A-Rv3425-Rv2029c （A39）,并对其免疫原性进行研究。首先用聚合酶链反应（PCR）扩增Ag85A基因,构建重组质粒pVAX1／Ag85A （A）;PCR扩增 Ag85A-Rv3425连接片段,插入pVAX1载体,构建重组质粒pVAX1／Ag85A-Rv3425（A3）;PCR扩增Rv2029c基因,插入A3,构建重组质粒pVAX1／Ag85A-Rv3425-Rv2029c （A39）。将构建成功的重组质粒转入 HEK293T细胞,蛋白免疫印迹法验证质粒在真核细胞中得到表达。在大肠埃希菌BL21中成功表达和纯化去除信号肽的Ag85A、Rv3425和Rv2029c蛋白。用质粒免疫C57BL／6小鼠,共分为5组：PBS、pVAX1、A、A3和A39组,采用电脉冲导入免疫,每2周免疫1次,共3次,用酶联免疫斑点检测（ELISPOT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术等方法检测细胞免疫和体液免疫水平。结果显示,A39免疫小鼠后,能引发强烈的细胞免疫反应﹝γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素2（IL-2）高水平分泌﹞,外周血CD4＋／CD8＋ T细胞比值增加,CD8＋穿孔素＋ T细胞比例增加。结果表明,构建的A39 DNA疫苗能引发强烈的免疫反应,显示出良好的抗结核潜力,可作为结核分枝杆菌新型候选疫苗。     

幽门螺杆菌Lpp20-IL2核酸疫苗免疫活性

【目的】观察pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2免疫C57BL/6小鼠后所产生的体液免疫和细胞免疫应答水平,为研制高效、新型的幽门螺杆菌核酸疫苗提供实验依据。【方法】构建pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2重组载体,并转染HeLa细胞,用Western-blot观察鉴定其在真核细胞得到表达后免疫C57BL/6小鼠,ELISA间接法测定小鼠血清中抗Lpp20IgG抗体水平,ELISA双抗体夹心法检测脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL4水平,MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应,免疫荧光组化法检测Lpp20蛋白在小鼠肌肉组织中的表达情况。【结果】成功构建了pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2真核表达载体,且重组质粒能在HeLa细胞内有效表达目的蛋白;小鼠接种pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2核酸疫苗后能产生特异性IgG抗体,8w后ELISA测定血清抗体A450值明显升高。核酸疫苗pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,培养上清中IFN-γ、IL4含量明显升高。pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2和pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数明显高于空质粒组和PBS组。Lpp20蛋白在小鼠肌肉组织中能够有效表达。【结论】幽门螺杆菌Lpp20-IL2融合基因核酸疫苗和Lpp20单基因核酸疫苗均能刺激机体产生较强细胞免疫应答和体液免疫应答,且前者能诱导更强的细胞免疫应答。     

结核分枝杆菌Rv2626c诱导的细胞免疫应答特性

全球有近1/4的人感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)并长期处于潜伏感染状态。Rv2626c是结核分枝杆菌受DosR调控的重要潜伏感染相关蛋白。本研究对Rv2626c蛋白进行了原核表达和纯化,并以RAW264.7细胞和小鼠为感染模型,对其免疫生物学特性进行了分析。SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明,Rv2626c-His融合蛋白主要以可溶形式表达,能与兔抗H37Rv多抗血清发生特异性免疫反应。此外,本研究发现Rv2626c蛋白能结合到巨噬细胞RAW 264.7表面并上调细胞NO的生成;显著诱导促炎细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6和MCP-1的产生;并能诱导小鼠产生更强的Th1免疫应答。上述研究有利于揭示结核分枝杆菌的致病机制,为新型结核病疫苗的研制奠定了理论基础。     

表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力

目的:测定表达肝素结合血凝素(HBHA)和人白细胞介素12(hIL-12)融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导产生的免疫应答及对结核分枝杆菌感染的保护作用。方法:将表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌采用同源加强免疫的方法免疫小鼠,检测小鼠外周血中IFN-γ、IL-2和IL-12的表达水平;用结核分枝杆菌感染免疫小鼠,检测小鼠肺部荷菌量和组织病理变化。结果:表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导小鼠产生以IFN-γ、IL-2分泌量增加为主的Th1型免疫应答,并能有效减少感染小鼠肺部结核分枝杆菌的荷菌量和病理损伤。结论:表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠可诱导产生与卡介苗相当的保护作用,可能成为控制结核病的有效疫苗。