经NGR肽段遗传修饰的携带三种报告基因的腺病毒载体的构建及其实验研究

NGR(Asn-Gly-Arg)是通过噬菌体展示技术筛选出来的能够和肿瘤新生血管特异结合的三肽模体,可以将多种药物分子和病毒载体靶向运输到肿瘤或者进行血管再生的组织中。为此构建了腺病毒衣壳蛋白knob的HI环(HI-loop)经NGR肽段修饰的并同时表达三种报告基因的腺病毒载体Ad5/E1-mCherry/E3-luciferase-2A-eGFP/knob-NGR。体内、外实验研究表明,该病毒载体可成功表达三种报告基因;经NGR肽段修饰的腺病毒载体对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的感染效率高于未经修饰的对照腺病毒Ad5CMVeGFP。该载体的成功构建为进一步研究经NGR肽段修饰的腺病毒在肿瘤动物模型体内的靶向性及经NGR肽段修饰的并携带治疗基因的实验治疗研究奠定了基础。     

原核生物中蛋白质的赖氨酸乙酰化修饰

翻译后修饰(post-translational modification,PTM)可以调节蛋白质的结构、稳定性和功能。作为一种PTM,赖氨酸乙酰化修饰被发现存在于三界生物中,参与了包括中心代谢、转录调控、蛋白质合成、细胞形态、细胞周期、信号通路调控、应激反应、病原微生物感染调控等多个重要的生理学进程。近年来,高分辨率质谱、高亲和泛乙酰化蛋白抗体的富集纯化等多种技术的发展和运用逐渐揭开了原核生物中蛋白质乙酰化修饰的面纱。乙酰化修饰在原核生物中广泛存在,且起着功能调控的作用。现简要介绍蛋白质乙酰化修饰的研究历史和原核生物中乙酰化修饰的调节机制,并重点总结若干已有具体研究的乙酰化修饰蛋白质,探讨原核生物蛋白质乙酰化修饰研究中今后需要解决的问题。     

葡萄糖修饰人血浆载脂蛋白的肽类标志物

目的:研究葡萄糖对血浆中载脂蛋白的修饰作用,寻找标志性肽段,作为临床诊断糖尿病以及衰老相关疾病的生物标志物。方法:将蛋白质组学和生物信息学相结合,采用LC/MS联用技术寻找差异肽段。结果:载脂蛋白(APOA1)与葡萄糖发生糖基化反应,导致正常肽段的含量发生变化,并生成早期糖基化产物果糖胺。而糖尿病人体内的APOA1也同样会发生这种非酶糖基化修饰,其中的一些肽段也出现类似的变化情况。结论:筛选出五个肽段,将有可能作为临床诊断糖尿病以及与衰老相关疾病的生物标志物。     

棒状链霉菌中隐性羊毛硫肽CLA 124的半体外生物合成

摘要:【目的】利用半体外生物合成方法获得棒状链霉菌中的隐性羊毛硫肽,为放线菌中羊毛硫肽资源的挖掘提供借鉴。【方法】利用nisin修饰系统,在大肠杆菌(Escherichia coli)中对隐性羊毛硫肽的核心肽进行体内修饰。修饰后产物经亲和层析和高效液相色谱(HPLC)纯化后,体外酶切反应切除前导肽,利用MALDITOFMS检测核心肽的脱水情况,并结合二级质谱解析其成环结构。【结果】获得了新的羊毛硫肽CLA 124,其核心肽脱去了4分子水,并形成2个硫醚键和一个二硫键。【结论】半体外生物合成方法可用于放线菌来源隐性羊毛硫肽的资源挖掘。     

用飞行时间质谱研究尿素对重组人肝再生增强因子的修饰作用

为研究尿素在变性、复性过程中对重组人肝再生增强因子 (recombinanthumanaugmenterofliverregeneration ,rhALR)的修饰作用及被修饰后蛋白质的结构和生物活性 ,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪 (MALDI TOF MS)测定蛋白质分子量及以胰蛋白酶酶解后的蛋白质各肽段的分子量 ,验证蛋白质是否被修饰 ,以急性肝损伤动物模型检测被修饰后蛋白质的生物活性。结果包涵体用尿素变性、复性 ,再经纯化获得的rhALR分子量为 30780 ,比理论分子量 30 0 98增加 6 82 ,且含有赖氨酸残基的酶解肽段分子量增加 4 3。采用盐酸胍变性、复性 ,再经纯化获得的rhALR分子量为 30 0 87,与理论值基本吻合。含赖氨酸残基的酶解肽段分子量亦正常。说明尿素可对rhALR蛋白肽链上的赖氨酸残基修饰。活性实验表明虽然尿素分解释放的氰酸盐在变性复性过程中能与蛋白质肽链上赖氨酸的ε氨基结合 ,造成rhALR蛋白质分子量增加 ,但被修饰的rhALR仍能提高四氯化碳致肝损伤小鼠的存活率。     

烯醇化酶1多肽共价修饰改变细胞的生长和代谢模式

文章利用斑马鱼胚胎成纤维细胞(PAC2), 研究烯醇化酶1(Enolase1, ENO1)多肽生化功能及其共价修饰的影响。首先体外合成甲基修饰、乙酰修饰、磷酸修饰和未修饰的ENO1多肽, 分别处理PAC2细胞, 然后检测处理细胞CCK-8、胞内外乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)和二磷酸甘油酸(2-phosphoglycerate, 2-PG)相对含量; 以及线粒体和溶酶体完整性; 同时利用PCR ARRAY试剂盒比较葡萄糖代谢通路变化。结果表明不同修饰的多肽处理后, 细胞增殖, 溶酶体和线粒体形态, 以及糖代谢通路发生了不同程度的改变。为了进一步研究乙酰化修饰ENO1多肽促进细胞增殖的代谢机制, 又将乙酰化修饰的多肽和空白对照处理的PAC2细胞进行转录组测序。转录组分析进一步显示乙酰化修饰的ENO1多肽可以改变糖、脂、蛋白质代谢途径, 并激活与癌症和病毒感染病的KEGG通路。研究结果提示烯醇化酶1的多种生化功能可能是蛋白翻译后不同化学修饰的结果。     

应用IP-2D nano-HPLC-MALDI-TOF-TOF鉴定蛋白质泛素化修饰

近年来,在蛋白质研究中,特别是在蛋白质翻译后修饰(PTM)的研究中,生物质谱技术的应用越来越广泛,与纳升级HPLC的联合应用,使这一技术手段更加有效.针对泛素化在细胞功能调控中发挥关键作用的PTM的特点,将免疫沉淀、2D nano-HPLC和基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱(IP-2D nano-HPLC-MALDI-TOF-TOF)有机整合,建立了天然状态下蛋白质泛素化位点的鉴定方法,并应用这一方法确定出K562细胞内具有酪氨酸激酶活性的蛋白c-ABL的泛素化位点.为定性鉴定生理和病理状态下内源性蛋白的泛素化修饰提供了借鉴.     

基于RNA-Seq技术分析鼠源宿主防御肽对铜绿假单胞菌成熟生物被膜的清除作用

【目的】利用RNA-Seq技术探究修饰后的鼠源宿主防御肽CRAMP对铜绿假单胞菌PAO1成熟生物被膜的影响。【方法】采用结晶紫法检测生物被膜量,激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察生物被膜形态学变化;利用Illumina二代高通量测序平台,采用PE150测序策略分析了CRAMP修饰肽干预PAO1生物被膜与对照组在转录水平的基因表达差异;利用1,3-萘二酚方法测定了PAO1生物被膜中藻酸盐含量。【结果】CRAMP修饰肽能显著减少PAO1成熟生物被膜量,并且在0.98–62.50μg/mL范围内呈一定浓度依赖性,CLSM显示CRAMP修饰肽能够显著减少细菌总荧光强度。转录组测序获得了12636700段干净读对,共鉴定出1582个差异基因,发现800个基因表达上调,782个基因表达下调。GO功能富集分析显示,1226个基因比对到GO功能分析数据库,在这些差异表达基因中,与分子功能、生物过程和细胞组成有关。KEGG通路富集分析显示,有603个表达差异显著基因比对到KEGG中的96条代谢途径,其中主要是各类氨基酸代谢途径、脂肪酸代谢途径、三羧酸循环、生物被膜调控系统等。分析发现CRAMP修饰肽可能作用于PAO1 c-di-GMP系统,增强细菌运动性和生物被膜分散,并且与其密度感应(quorum sensing,QS)系统和藻酸盐合成相关。最后经验证,CRAMP修饰肽显著减少了PAO1成熟生物被膜中藻酸盐的含量。【结论】CRAMP修饰肽对PAO1成熟生物被膜具有明显的清除作用,且能导致成熟生物被膜藻酸盐含量下降。通过转录组数据分析,可能是由于CRAMP修饰肽使PAO1c-di-GMP水平下调导致的,具体机制还有待进一步探究。     

固相化学辅助MALDI-TOF质谱源后衰变技术对2D-胶银染蛋白质点的鉴定

利用O 甲基异脲氢硫酸 (O methylisoureahydrogensulfate)修饰 2D 胶上胰蛋白酶原位酶切后产生的Lys 肽 ,使其具有Arg 肽的特性 ,提高质谱测定的灵敏度 ,然后用化学试剂 3 磺酸丙酸N 羟基琥珀酰胺酯 ( 3 sulfopropionicacidNHS ester)修饰Lys 肽及Arg 肽 ,修饰的产物在进行PSD测序时能得到单一的y 离子系列 ,有利于蛋白质酶解片段序列的从头解析 ,为 2D 胶上蛋白质点的准确鉴定提供有力的依据 ;该方法应用于鼻咽癌细胞 2D胶银染蛋白质点的鉴定取得可靠结果     

多肽表面修饰脂质体药物递送系统

本文通过查阅并归纳近几年相关文献,较为系统地概述了靶向活性多肽、细胞穿膜肽和靶向细胞穿膜肽等多肽表面修饰脂质体药物递送系统(drug delivery system, DDS)的研究进展。经不同活性多肽表面修饰,或可增强脂质体DDS的靶向性,或可提高药物的细胞摄取率和生物利用度。总之,多肽表面修饰的脂质体在新型DDS研究及应用中具有良好的前景。     

抗微生物肽CRAMP联合抗生素分散铜绿假单胞菌生物被膜的增效作用研究

【目的】研究修饰后的鼠源抗微生物肽CRAMP联用抗生素对铜绿假单胞菌PAO1成熟生物被膜的分散作用,为临床联合应用抗生物被膜药物提供理论依据。【方法】采用微量肉汤稀释法测定CRAMP修饰肽和抗生素对PAO1的最低抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC)和生物被膜最小根除浓度(MBEC);采用时间杀菌曲线(time-kill curve,TKC)法测定CRAMP修饰肽及抗生素单用和联用对PAO1成熟生物被膜的杀菌活性;采用菌落计数法和激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)评估CRAMP修饰肽联用抗生素对PAO1成熟生物被膜的分散作用。【结果】与单用抗生素组相比,除2种碳青霉烯类药物和4种β-内酰胺类药物,其他抗生素联合CRAMP修饰肽后的MBEC值均有不同程度的下降,万古霉素、罗红霉素和阿奇霉素下降倍数最明显(4倍)。TKC试验结果表明,CRAMP修饰肽分别联用万古霉素、罗红霉素和阿奇霉素均具有比单用药更快且更强的杀菌作用,尤其是与万古霉素联用仅在3h时杀灭了全部(100%)的生物被膜细菌。随后,通过CLSM观察发现生物被膜数量、体积、面积和单位面积荧光强度均有明显的变化。【结论】CRAMP...     

组蛋白降解调控机制的研究进展

组蛋白是染色质的重要组成部分,其含量的高低显著影响着染色质高级结构的形成、基因表达、DNA复制等重要生命活动。蛋白质降解是组蛋白含量调控的重要机制,大量研究表明,组蛋白的降解与其氨基酸残基的修饰方式有着密不可分的联系。此外,组蛋白的降解与其泛素化、乙酰化等共价修饰密切相关。该文以组蛋白氨基酸残基翻译后修饰(PTM)为关注点,重点介绍组蛋白降解与氨基酸残基修饰之间的相互关系,并对该领域的研究进展进行综述。     

兼职蛋白热休克蛋白70与α-烯醇酶的人B细胞表位肽预测及其瓜氨酸化的血清学检定

目的筛选与自身免疫病相关兼职蛋白的B细胞优势表位肽并进行血清学检定。方法利用DNAMAN软件分析不同物种热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)和α-烯醇酶氨基酸序列同源性,IEDB数据库和瓜氨酸化在线平台预测线性B细胞表位和瓜氨酸化修饰位点;间接ELISA检测抗HSP70和α-烯醇酶蛋白瓜氨酸化前后表位肽抗体。结果同源性分析和IEDB数据库预测得到兼职蛋白HSP70和α-烯醇酶各10个B细胞优势表位肽;瓜氨酸化位点预测显示,其分别有9个和4个位点可能会发生瓜氨酸化修饰,其中5个瓜氨酸化修饰位点与预测表位肽重合。与正常人相比,抗环瓜氨酸肽抗体阳性患者血清抗瓜氨酸化修饰表位肽的抗体滴度明显增高(P0.05)。结论采用生物信息学分析和ELISA初步验证的方法有助于筛选自身抗原相关的B细胞优势表位肽。     

脉搏波时标对臂踝脉搏波传播速度测量的影响

臂踝脉搏波传播速度(brachial-ankle pulse wave velocity,baPWV)测量是一种便捷、无创的方法,可用于人体动脉硬化度的评估,在临床和科学研究中广泛应用于血管早期病变的筛查和心血管系统风险的评估。本文设计开发了人体上臂和踝部脉搏波波形采集系统,并利用该系统对59名健康成年人进行实验,研究了目前三种最常用的脉搏波时标(pulse timing mark,PTM)定义方法对baPWV测量的影响。实验结果表明,选用不同的PTM方法所测得的baPWV结果具有显著的差异性(P0.001)。而且,PTM方法的不同还影响到了baPWV与年龄、血压的相互关系。     

基于高覆盖(磷酸化)蛋白质组对人胚胎干细胞干性维持调控网络的解析

目的:对人胚胎干细胞H9的(磷酸化)蛋白质组进行鉴定和深入分析,探讨维持人胚胎干细胞干性的核心调控网络。方法:利用新近发表的TAFT磷酸化肽段富集策略和高精度质谱鉴定技术,采用无标定量方法对H9细胞(磷酸化)蛋白进行定量分析;结合MOTIFX、iGPS、IPA等多种生物信息学分析软件,分析H9细胞的磷酸化基序-激酶、转录因子-靶基因调控网络。结果:获得了目前高度覆盖的H9细胞(磷酸化)蛋白质组数据集,鉴定到8674种蛋白质,其中3898种能够发生磷酸化修饰,包括13 676条磷酸化肽段,高可信度(class 1)磷酸化位点有11 870种。与已有的H9细胞磷酸化蛋白质组数据相比,其中2247种磷酸化蛋白质和10 025种磷酸化位点是本研究新鉴定到的。基于基序和激酶预测分析,推导出与干性维持相关的已知转录调节因子的新的磷酸化修饰基序以及调控其发生磷酸化的激酶。结合多能性转录因子对靶基因的调控信息,构建了多能性调控分子磷酸化修饰及其转录调控的核心网络。此外,还对特定位点的磷酸化修饰水平及其对应蛋白的总体丰度水平进行了比较及功能分析。基于各自的百分位数,比较磷酸化修饰水平与其对应蛋白的总体丰度,发现具有高丰度但低磷酸化修饰水平的蛋白倾向于参与物质转换或物质运输等生物过程,而低丰度但高磷酸化水平的蛋白质倾向于参与信息转导或调控过程。结论:提供了人胚胎干细胞H9高覆盖的(磷酸化)蛋白质组数据,这些数据有助于深入了解蛋白质磷酸化修饰在胚胎干细胞干性维持中所发挥的重要作用,为胚胎干细胞基础和应用研究提供了宝贵的数据资源。     

组蛋白 H3K79同型半胱氨酸修饰位点在神经管畸形中的作用

目的:探讨人类胚胎脑组织中是否存在H3K79同型半胱氨酸修饰(H3K79Hcy)及其在神经管畸形(NTDs)中的作用。方法:通过质谱检测组蛋白H3K79是否存在同型半胱氨酸修饰位点。进一步合成包含组蛋白H3K79位点的同型半胱氨酸(Hcy)修饰的肽段,并与牛血清白蛋白(BSA)偶联后免疫兔子得到抗组蛋白H3K79Hcy多克隆抗体,并对抗体进行特异性检测;采用此抗H3K79Hcy抗体比较人类高Hcy NTDs样本和正常对照样本的H3K79Hcy水平。结果:(1)人胚胎组织组蛋白H3K79位点存在同型半胱氨酸修饰;(2)高Hcy水平NTDs脑组织中H3K79Hcy修饰水平高于正常对照(P0.05)。结论:人胚胎组织存在H3K79Hcy修饰,此修饰异常可能促进神经管畸形的发生。     

分子内分子伴侣机制的研究进展

在原核生物、真核生物及病毒中,一些蛋白质的折叠不符合Anfinsen原则,即依靠自身的氨基酸序列是不够的,还需一段被称为分子内分子伴侣(IMC)的肽段来协助折叠．根据机制不同,IMC可分为两类：第一类IMC引导成熟肽折叠为具有空间结构的蛋白质;第二类IMC协助成熟肽的多聚化而使其获得生物学功能．IMC能提供比分子伴侣更契合的结构,更有效地引导成熟肽折叠,是一种更优的折叠策略．研究IMC分子机制,不仅能够确定IMC上哪些残基的协同作用引导成熟肽折叠,而且可通过改变或修饰其侧链来改造成熟肽,拓展传统的蛋白质工程．     

超氧化物歧化酶翻译后修饰的研究进展

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是生物体内存在的一种抗氧化金属酶,它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧(O₂)和过氧化氢(H₂O₂),在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用,且与很多疾病的发生、发展密不可分。对SOD的活性调节一直是研究热点,大多数研究都集中在转录水平(基因表达)和翻译水平(酶蛋白合成)两个方面。随着研究的深入,发现蛋白质翻译后修饰(PTM)对SOD的酶活性有重要影响。近年来,研究蛋白质翻译后修饰对SOD的酶活性的影响越来越受到重视。总结了硝基化、磷酸化、S-谷胱甘肽化、糖基化、乙酰化、次磺酸化、亚磺酸化、SUMO化等几种SOD翻译后的修饰方式,讨论了修饰后对SOD酶活性的影响和生理意义,并对SOD翻译后修饰的发展及面临的挑战进行了展望,为相关疾病的研究、治疗及靶向药物的研制提供了理论基础。     

泛素化修饰组学技术及其在疾病研究中的应用

泛素化修饰作为真核细胞内主要的蛋白质翻译后修饰之一，通过泛素-蛋白酶体系统(UPS)介导了细胞内的蛋白质特异性降解，同时广泛参与并调控细胞内基因转录、信号传导、DNA损伤与修复、细胞周期调控、应激反应甚至个体的免疫应答等几乎所有的生命活动过程。泛素-蛋白酶体系统的精确调控构成了稳定而复杂的泛素化信号网络，而其失调通常会造成癌症、神经退行性疾病、代谢性疾病等多种疾病的发生发展。近年来，基于质谱(MS)的蛋白质组学逐渐成熟，并极大促进了泛素化修饰研究的深度与广度。依托于泛素化蛋白质/肽段富集技术的发展以及高通量、高覆盖度和高灵敏度的质谱检测技术平台，蛋白质泛素化修饰组学也得以快速发展，并逐渐应用于人类生理、病理状态的泛素化蛋白质组研究和疾病发生发展的机制探索。本文主要综述了泛素化修饰组学研究中的泛素化蛋白质/肽段富集方法、质谱鉴定技术、定量标记技术和数据处理方法，同时对泛素化修饰组学技术在疾病研究中的应用也进行了系统分析，理清了当前存在的问题与挑战，为泛素化修饰蛋白质的发现与鉴定提供参考，为相关疾病治疗靶点的筛选和药物研发提供思路。     

前导肽二级结构对bovicin HJ50修饰和加工的影响

[目的]阐明羊毛硫细菌素bovicin HJ50前导肽的二级结构对原肽修饰和加工的影响规律.[方法]采用半体外生物合成系统构建boviein HJ50前导肽突变体,然后利用MALDI-TOF质谱鉴定成熟肽的修饰情况.同时,结合HPLC和抑菌活性分析其对成熟肽加工效率的影响.[结果]我们构建了6个bovicin HJ50前导肽二级结构相关的突变体(F-16A,V-15E,E-14L,E-8P,L-7D,L-4K).F-16A,V-15E,L-4K几乎不影响修饰和加工;E-14L和E-8P的修饰则发生了变化;另发现L-7D导致加工过程受到强烈抑制.[结论]Bovicin HJ50前导序列中保守的螺旋结构区对修饰酶BovM和蛋白酶BovT150活性都有不同程度影响,其二级结构的维持对bovicin HJ50的修饰和加工具有重要作用.