羊毛硫细菌素bovicin HJ50修饰酶BovM双功能域单独催化活性鉴定

【目的】体外重建羊毛硫细菌素bovicin HJ50修饰酶Bov M双功能域(脱水酶与环化酶功能域)各自的催化活性,为深入了解Bov M催化机制奠定基础。【方法】在大肠杆菌(Escherichia coli)中分别异源表达纯化Bov M含脱水功能域的N端与含环化功能域的C端重组蛋白,构建体外反应体系,分别对其前肽底物Bov A进行修饰,通过产物抑菌活性及MALDI-TOF MS分子量检测来鉴定两者的修饰活性;并通过体内体外两种方法检测双功能域蛋白之间的协同作用。【结果】Bov M的N端脱水功能域及C端环化功能域分别具有脱水与环化活性,但双功能域重组蛋白之间没有协同作用。【结论】Bov M双功能域均可独立行使各自的催化功能,但Bov M的完整结构对其正常的催化活性非常重要。     

来自穿膜肽的新肽的抗菌活性及抑菌机制

[目的]研究基于穿膜肽和抗菌肽构效关系改造获得的新肽P7的抗菌活性及其对大肠杆菌(E.coli)的抑菌机制.[方法]微量稀释法和溶血实验分析P7的抑菌活性及其对正常细胞的细胞毒性;采用膜荧光探针、流式细胞术和扫描电镜分析P7对E.coli膜通透性、膜完整性的影响和细胞超微结构变化;通过激光共聚焦分析P7在E.coli细胞中的定位;凝胶阻滞实验测定P7与E.coli基因组DNA结合能力.[结果]P7比母肽显示更强的抑菌活性,最低抑菌浓度范围为4-32 μmol/L,且在作用浓度范围内具有较弱的溶血活性.P7可以增加E.coli外膜和内膜的通透性,使E.coli细胞膜的完整性和细胞表面结构受损.同时P7可以穿过E.coli细胞膜在细胞质聚集并与基因组DNA结合.[结论]P7通过增加E.coli内外膜通透性,穿过细胞膜与胞内DNA结合发挥抑菌活性.     

鞘糖脂内切糖苷酶的半理性设计

[目的]对鞘糖脂内切糖苷酶EGCaseⅡ进行半理性设计,获得高水解活性突变体。[方法]用半理性设计方法进行突变库设计,利用HPLC对突变库进行筛选,随后对阳性突变体进行动力学及底物谱表征,并利用结构建模对活性提高的分子机制进行解析。[结果]获得了对鞘糖脂GM1、GM3水解活性提高的突变体S63G/D311E、I276L/D311V,活性分别提高为野生型的25.3倍、11.8倍。酶动力学表征显示,S63G/D311E的K_M由0.17 mmol/L降低到0.06 mmol/L,kcat由5.5 min~(-1)增大到50.3 min~(-1)。酶-底物复合物模式结构分析表明,D311E、D311V、I276L这几种突变更有利于酶与底物结合,从而提高酶活性。[结论]通过半理性设计成功获得对GM1和GM3水解活性分别提高25.3倍和11.8倍的EGCaseⅡ突变体。     

单活性结构域T7核酸酶Ⅰ的制备及性质研究

T7核酸酶Ⅰ(T7EⅠ)是一种能特异识别并拆分重组中间体Holliday Junction(HJ)的多功能核酸酶,该酶不仅能特异识别和拆分HJ,而且能随机切刻双链DNA,特异识别并切割双链DNA中的切刻和单碱基错配位点.构建了两种原核表达载体用于表达MBP和His-tag融合的两种T7EⅠ突变体,MBP-T7EⅠ(E20K)和His6-T7EⅠ(E65K).每一种融合蛋白形成的同源二聚体不具有核酸酶活性,通过共表达或两种蛋白质共变性复性、双标签亲和纯化,最终获得具有单个活性结构域的T7EⅠ异源二聚体(T7EⅠ-SAD).以pUC(AT)和pUC19为底物测试T7EⅠ-SAD的HJ拆分活性、随机切刻活性和切刻位点切割活性,结果显示,T7EⅠ-SAD可特异识别并切刻HJ结构,但丧失了同时引入两个切刻位点的能力,其对pUC(AT)的特异切刻活力和对pUC19的随机切刻活力与野生酶相当.逐级变性梯度洗脱实验显示,T7EⅠ-SAD的稳定性与野生型酶接近,二聚体解离需要5.0～6.0mol/L尿素或1.75～2.0mol/L盐酸胍;凝胶阻滞实验表明T7EⅠ-SAD具备与HJ结构特异结合的能力.为具有细胞毒性蛋白的表达提供...     

马尔堡病毒GP蛋白C肽的抑制活性及作用机理研究

目的:研究马尔堡病毒(MARV)包膜糖蛋白(GP)C肽的抗该病毒进入活性及初步作用机制。方法:选取MARV的GP2蛋白上CHR区域序列(611～637残基),合成该序列多肽(C肽)及突变体,利用pVAX1-MGP与pNL-4.3-Luc-R-E-质粒包装假病毒体系,测定各肽对马尔堡假病毒融合的抑制活性,利用圆二色谱、凝胶色谱分析C肽及其突变体对MARV的N肽的相互作用。结果:C肽对马尔堡假病毒融合抑制的IC_(50)为32.67μmol/L,C肽突变体的IC_(50)为9.61～33.47μmol/L,抑制活性高于C肽或与其相当;C肽与N肽形成双螺旋结构,在C肽的7元螺旋体的b、f、c、g位引入离子相互作用氨基酸可提高多肽本身的α螺旋结构含量,一些突变可提高复合物的α螺旋结构含量,但C肽与N肽混合后形成的复合物含量不高。结论:MARV的GP蛋白C肽与N肽相互作用较弱,C肽的抗病毒活性较弱,但改造后可提高活性。     

色氨酸残基在碳-碳水解酶催化中的关键作用

碳-碳水解酶（C-C水解酶）作为α/β水解酶超家族中的一员,负责催化环裂产物C-C键的断裂,该反应是细菌降解芳香族化合物途径中的关键步骤. 为了解水解酶的催化特性,本文对该酶部分氨基酸进行了定点突变,并对突变体的动力学参数,化学修饰剂对突变体活性的影响以及突变体的二级结构进行了测定.各突变体的动力学参数特征为：突变体S110A,H265A和D237A的催化效率为野生型的1/104~1/103;突变体W85A和W219A催化效率分别为野生型的5/18和1/3,而同为色氨酸的突变体,W266A的催化效率只有野生型的1/104. 化学修饰剂对突变体S110A,H265A,D237A和W266A的酶活性几乎没有影响;而对突变体W85A和W219A却有较大的影响,修饰后,其相对活性仅为对照的10%~30%. 突变体的圆二色谱（CD谱）分析表明,与野生型相比,突变体的二级结构没有发生改变. 证明了Ser110,Asp237,His265是2-羟基-6-氧-6-苯基己-2,4-二烯酸水解酶（HOPDA hydrolase, HOPDA水解酶）催化反应所必需的氨基酸,并提出了Trp266在催化反应中也同样起到了非常关键的作用.     

苦荞α-螺旋发夹抗菌肽的分子改造抑制植物真菌活性

本研究对来源于苦荞的α-螺旋发夹抗菌肽FtAMP抗真菌机制与结构之间的关系进行了研究。首先人工合成了FtAMP分子中N-端和C-端的α-螺旋(FtAMP-N和FtAMP-C）,探究两个α-螺旋究竟是哪个螺旋在起抗菌作用。然后以FtAMP为模板,α-螺旋区电荷和两亲性特征为变化要素,利用螺旋轮投影和特定氨基酸残基替换的方法,对其进行初步分子改造,并通过对多肽结构和活性比较,探讨FtAMP结构-功能的关系。研究表明,FtAMP-N和FtAMP-C都显示出良好的抗菌活性。根据螺旋轮投影方法分析螺旋的两亲性特征,并以FtAMP氨基酸序列为模板,分别表达4个FtAMP突变体(FtAMP-E12A、FtAMP-E12A/E9K、FtAMP-E12A/E9A和FtAMP-E12A/E9K/T24E）。圆二色光谱分析显示,4个多肽都可正确折叠成α-螺旋结构,在208 nm和222 nm处有典型的双负峰,表明氨基酸的改变及其表达过程中并未改变多肽的二级结构。抗真菌活性分析显示,与FtAMP相比,4种突变体对植物真菌的抑制作用均有一定增强。特别是FtAMP-E12A/E9K突变体,其抗真菌作用增强约1倍,同时诱导溶血活性并不显著,选择特异性提高近2倍。该研究也进一步表明,α-螺旋发夹抗菌肽发挥抗真菌效应主要与其螺旋结构有关,而与其抑制剂的活性位点没有关系,为该类抗菌肽结构和功能的关系提供了一定的参考。     

Tyr78-loop对鱼腥藻来源苯丙氨酸脱氨酶活性的影响

【背景】MIO(Methylidene-imidazol-5-one)依赖型酶中,催化因子Tyr所在Loop(Tyr78-loop)的灵活性显著影响酶学性质。【目的】探讨Tyr78-loop对鱼腥藻来源苯丙氨酸脱氨酶酶活的影响,以提高其反应活性。【方法】将该酶的Tyr78-loop进行分子改造,筛选出酶活提高的突变体,并对突变体的酶学性质进行研究。【结果】突变体S73N、E95V、E95K和S73N/E95K在37°C、pH 8.5下比活分别比原酶提高了34%、30%、18%和35%。蛋白三维结构模拟推测在突变体S73N、E95V和E95K中,位于α螺旋与Tyr78-loop交界处的Asn73、Val95和Lys95与附近氨基酸的氢键作用力数目减少,一定程度上增加了Tyr78-loop的柔性。【结论】Ser73位和Glu95位氨基酸的突变增加了Tyr78-loop的灵活性,提高了苯丙氨酸脱氨酶的酶活。     

耐热高活性荧光素酶在单细菌检测中的应用

[目的]开发活性和稳定性提高的荧光素酶突变体,建立单细菌检测方法。[方法]运用定点突变的方法,向荧光素酶LGR中逐步引入提高荧光素酶稳定性的氨基酸位点,构建荧光素酶突变体LGR-A215L、LGR-E354K和LGR-LK,并建立基于单细菌检测的快速无菌检查方法。[结果] LGR-A215L、LGR-E354K和LGR-LK的活性分别提高了9、26和140倍,45℃的稳定性提高了约2.9、1.3和2.7倍;此外,NaCl、培养基和生物制品溶液对LGR-LK的活性影响较小,活性变化在74%～181%之间。LGR-LK与ATP之间的亲和力显著提高,能灵敏的检测到小于10 CFU/mL菌悬液中的细菌,信号/背景值≥200;在48 h以内检测到TSB培养基中的金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌,相较于LGR的检测灵敏度提高了约1.5倍。[结论]开发了热稳定高活性荧光素酶突变体LGR-LK,其活性提高了140倍,45℃的热稳定性提高了2.7倍,并且其活性不受生物制品、NaCl和培养基的影响,能灵敏的快速检测单个细菌,可用于生物制品快速无菌检查。     

pta基因敲除对L-色氨酸发酵的影响

[目的]探究pta基因缺失对大肠杆菌发酵生产L-色氨酸的影响.[方法]运用Red重组技术敲除pta基因,构建pta缺失株E.coli TRTH△pta.利用30 L发酵罐进行分批补料发酵试验,考察重组菌E.coliTRTHApta发酵0生产L-色氨酸过程中生物量、L-色氨酸产量、有机酸含量、发酵液中NH4+浓度及变化....     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.