不同地理种源南方红豆杉中紫杉醇和10-DAB含量及影响因子

选择福建省梁野山、龙栖山、闽侯旗山、南靖书洋乡和南平大坪村南方红豆杉(Taxus chinensis var.marei)天然群体分布相对集中区,采集胸径相同的南方红豆杉的当年生针叶和树皮并取树下土壤样品.利用超高效液相色谱分析测定南方红豆杉当年生针叶及树皮中紫杉醇及10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-deacetylbaccatin Ⅲ,10-DAB)含量,另测定土壤pH值、速效磷、速效氮、铁、钙、镁、锌含量.结果表明,不论是紫杉醇还是10-DAB含量,不同地理种源南方红豆杉间差异均较大,说明地理位置对于红豆杉中紫杉醇和10-DAB含量具有明显的影响;树皮中紫杉醇含量与土壤中铁含量显著相关(P<0.01);南方红豆杉当年生针叶中及树皮中紫杉醇含量与各种源地气象因子的相关性不显著(P>0.05).     

不同地理种源南方红豆杉中紫杉醇和10-DAB含量及影响因子

选择福建省梁野山、龙栖山、闽侯旗山、南靖书洋乡和南平大坪村南方红豆杉（Taxus chinensis var. marei）天然群体分布相对集中区,采集胸径相同的南方红豆杉的当年生针叶和树皮并取树下土壤样品。利用超高效液相色谱分析测定南方红豆杉当年生针叶及树皮中紫杉醇及10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-deacetylbaccatin Ⅲ, 10-DAB）含量,另测定土壤pH值、速效磷、速效氮、铁、钙、镁、锌含量。结果表明,不论是紫杉醇还是10-DAB含量,不同地理种源南方红豆杉间差异均较大,说明地理位置对于红豆杉中紫杉醇和10-DAB含量具有明显的影响;树皮中紫杉醇含量与土壤中铁含量显著相关（P＜0.01）;南方红豆杉当年生针叶中及树皮中紫杉醇含量与各种源地气象因子的相关性不显著（P＞0.05）。     

叶面施肥对南方红豆杉针叶中紫杉醇和10-DAB含量的影响

人工栽培红豆杉已成为目前解决紫杉醇市场需求的主要途径,如何提高人工栽培的红豆杉中紫杉醇及其化学半合成前体10-脱酰基巴卡丁Ⅲ(10-DAB)的含量是一个十分关键的问题.对人工栽培南方红豆杉叶面喷施不同浓度的N、K、Ca、Mg 肥和自行配置的稀土混合肥(含La、Ce、Sm),连续4次跟踪采样,超高效液相色谱(UPLC)测定样品中紫杉醇和10-DAB的含量.结果表明,叶面喷施不同浓度的N元素均引起红豆杉针叶中紫杉醇和10-DAB含量的降低;喷施K元素,前期引起10-DAB含量的增加但随之降低,紫杉醇的含量则持续降低;喷施不同浓度的Ca、Mg提高了红豆杉中紫杉醇和10-DAB的含量,其作用可持续一段时间;自行配置的稀土混合肥明显地提高了紫杉醇和10-DAB的含量且其持续作用时间较长,紫杉醇和10-DAB的含量分别最高可达0.261mg g-1和0.641mg g-1.     

遮光对南方红豆杉生长及紫杉醇含量的影响

通过设计1年以上的长期遮光处理,对南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)当年生幼苗、3年生和5年生幼株的生长及5年生幼株不同遮光处理后针叶中紫杉醇和其前体(10-脱酰基巴卡丁Ⅲ)含量进行了测定.结果表明,光照是影响红豆杉幼苗和幼株生长的一个重要环境因子,当年生南方红豆杉幼苗必须在荫蔽环境下才能保证高的成活率和健康的生长态势,对于3龄红豆杉幼株,全光照下,50%左右的红豆杉幼株死亡,对于5龄南方红豆杉植株,30%遮光率下有利于其健康生长;5年生南方红豆杉幼株全光照处理下的植株针叶中紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁Ⅲ含量高于其他光照条件下的植株.南方红豆杉幼株针叶紫杉醇和10-脱酰基巴卡丁Ⅲ的最佳积累光照条件与其最适宜的生长发育光照环境并不完全平行.     

南方红豆杉人工引种及野生植株活性成分含量与分布

南方红豆杉是我国特有的濒危植物,因其具有抗癌药用价值而被过度采集,导致现存种群减少.采用超声辅助提取和HPLC检测人工引种及野生南方红豆杉植株中紫杉醇、7-木糖紫杉醇、三尖杉宁碱等活性成分含量,分析其在不同部位、年限和坡向的分布规律.结果表明:南方红豆杉人工引种后,植株中的紫杉醇、7-木糖紫杉醇和三尖杉宁碱含量变化明显,野生植株中紫杉醇含量显著高于人工栽培植株,约为栽培植株的1.8倍,其他2种物质含量以人工栽培略高.不同部位、冠层样品中3种活性物质含量差异显著,以茎皮、高冠层枝叶含量较高.不同年限南方红豆杉植株中紫杉醇、7-木糖紫杉醇和三尖杉宁碱含量以4年生植株较高,分别为0.08、0.91和0.32 mg·g-1.不同坡向植株中3种活性成分含量以阳坡植株较高,紫杉醇和7-木糖紫杉醇含量差异显著,三尖杉宁碱含量差异不显著.南方红豆杉中3种活性成分的积累与光照条件密切相关,栽培过程中适当增加光照有利于3种活性成分的积累.     

南方红豆杉枝叶中药用抗癌活性物质含量

通过高效液相色谱（HPLC）,测定了人工栽培南方红豆杉枝叶中药用抗癌活性物质紫杉醇（taxol）、三尖杉宁碱（cephalomannine）和人工半合成紫杉醇的主要原料巴卡亭Ⅲ（baccatin Ⅲ）、10 去乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-deacetylbaccatin Ⅲ,10-DAB）在一个生长季的含量变化.研究表明：从4月新枝叶萌发至11月枝叶基本停止生长,南方红豆杉枝叶中紫杉醇等药用活性物质含量季节性变化明显.其中紫杉醇和三尖杉宁碱含量的最高值都出现在5月;巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量的最高峰值分别出现在9月和4月.相关分析发现,南方红豆杉枝叶中4种药用活性物质之间有很好的相关性,其中紫杉醇与三尖杉宁碱含量呈显著正相关(P<0.05),三尖杉宁碱含量与10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量呈显著负相关(P<0.05).     

南方红豆杉枝叶中6种紫杉烷类化合物含量季节变化

紫杉醇(taxol)是主要来源于红豆杉属植物的一种天然抗肿瘤药物,紫杉烷(taxane)是紫杉醇的代谢前体或支路代谢产物,同样具有开发成为抗肿瘤新药的潜质。本文采用高效液相色谱法研究了紫杉醇(Taxol)、10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)、7-木-10-去乙酰紫杉醇(7-xyl-10-DAT)、10-去乙酰紫杉醇(10-DAT)、三尖杉宁碱(CE)和7-表-10-去乙酰紫杉醇(7-epi-10-DAT)6种紫杉烷类化合物在南方红豆杉枝叶中含量的季节变化,结果显示Taxol和10-DAT在8、9月份含量最低,10-DAB和7-xyl-10-DAT在8、9月份含量相对最高,Taxol含量季节变化和10-DAB呈负相关,与CE呈显著正相关。7-xyl-10-DAT含量季节变化和10-DAB、10-DAT分别呈正相关。本文为研究南方红豆杉中紫杉醇及相关紫杉烷的代谢、积累规律提供了依据,不但有助于阐明紫杉醇的生物合成的关键步骤及调控的生理机制,而且对红豆杉资源的深度开发具有指导意义。     

细菌肥料Agr、PfPt和Mic对曼地亚红豆杉幼苗生长和次生代谢物含量的影响

运用单因素随机区组设计,在田间栽培条件下,对曼地亚红豆杉(Taxus media Rehder)1年生幼苗施用3种细菌肥料﹝放射性土壤杆菌肥料(Agr)、荧光假单胞菌肥料(PfPt)和微球菌肥料(Mic),浓度为2×107 CFU·mL-1,施肥2次﹞,对翌年生长期幼苗株高和冠幅的增长量变化以及枝叶中4种次生代谢物﹝紫杉醇、三尖杉宁碱、10-去乙酰紫杉醇和10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB Ⅲ)﹞含量进行比较分析。结果表明：施用Agr、Mic和PfPt后的翌年11月份,曼地亚红豆杉幼苗株高和冠幅的增长量均大于CK(不施肥,对照)组,其中,施用PfPt后幼苗株高增长量最大,且显著高于CK组(P<0.05);施用Mic后幼苗的冠幅增长量最大,但与CK组间无显著差异(P>0.05)。施用Agr、Mic和PfPt后枝叶中紫杉醇、三尖杉宁碱和10-DABⅢ含量均显著高于CK组,其中,施用Mic后紫杉醇含量最高,施用PfPt后三尖杉宁碱和10-DAB Ⅲ含量最高,且总体上显著高于其他处理组;施用Mic后10-去乙酰紫杉醇含量最高,且显著高于CK组及其他处理组,而施用Agr和PfPt后10-去乙酰紫杉醇含量与CK组无显著差异。研究结果显示：施用Agr、Mic和PfPt均对曼地亚红豆杉幼苗生长以及枝叶中次生代谢物积累有一定的促进作用,但不同细菌肥料的促进效应存在差异,因此,在曼地亚红豆杉的栽培过程中应根据不同需求选择适宜的细菌肥料。     

赤霉素和烯效唑对东北红豆杉紫杉醇代谢的影响

以一年生东北红豆杉扦插苗为材料,采用Hoagland营养液添加赤霉素及其合成抑制剂烯效唑的方法,研究了不同处理对东北红豆杉紫杉醇(taxol)及其前体巴卡亭Ⅲ(baccatinⅢ)与10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)含量变化的影响,同时比较了苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和超氧化物酶(SOD)活性变化,分析了紫杉醇合成旁路途径物质及抑制剂对紫杉醇代谢的作用效应.结果表明,不同浓度赤霉素(GA3)和烯效唑(S3307)处理对东北红豆杉POD、SOD及PAL活性的影响不显著;但整个处理过程中叶片中紫杉醇含量均为对照的1.28～6.44倍,茎中紫杉醇、baccatinⅢ及叶片中10-DAB含量在第6天均高于相应对照;赤霉素与烯效唑对紫杉醇及其前体合成的作用途径存在一致性.     

水杨酸在紫杉醇生物合成中诱导作用的研究

研究了水杨酸对红豆杉细胞培养中紫杉烷合成的影响。在适宜浓度的水杨酸诱导下,紫杉醇(Taxol)的产量提高了近3倍,同时10去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)与巴卡亭Ⅲ(Baccatin Ⅲ)相应上升。通过对紫杉醇合成代谢途径的动力学分析,初步推断水杨酸的加入提高了10-DAB合成速率。并通过水杨酸和硝酸银的配伍诱导,实现了诱导子之间的协同作用,获得了39 mg/L的紫杉醇含量,比两个诱导子单独作用时的最高含量之和还高出50%。     

光胁迫对南方红豆杉叶片中叶绿体色素和紫杉醇含量的影响

研究了在光胁迫下南方红豆杉叶片中叶绿体色素含量和紫杉醇含量的动态变化。结果表明,与对照相比,叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量以及叶绿素a/叶绿素b比值在光胁迫下均减少,随胁迫时间的延长,叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量逐渐上升,叶绿素a与叶绿素b的比值先上升后下降;类胡萝卜素含量在前两周与对照相比降低,2周后高于对照;类胡萝卜素与叶绿素的比值高于对照,随胁迫时间的延长,其趋势先降低后上升。光胁迫处理后,南方红豆杉叶片中紫杉醇含量与对照相比,在第1周时略有下降,而后随胁迫时间的延长,紫杉醇含量在第2周开始迅速大量积累,而在处理3周时达到较高值,已增加到1.5倍,这对提高人工种植的南方红豆杉中紫杉醇含量具有非常重要的意义。     

南方红豆杉毛状根诱导体系的建立及毛状根中 紫杉醇的分离纯化研究

目的:研究发根农杆菌对南方红豆杉转化的转化体系和毛状根中紫杉醇的提取纯化工艺;方法:采用发根农杆菌对南方红豆杉不同外植体进行诱导,并对影响毛状根转化的因素进行分析。采用超临界CO2流体萃取法、硅胶柱色谱法以及高效液相法对毛状根中的紫杉醇进行分离提纯;结果:成功构建了南方红豆杉毛状根诱导体系。其中农杆菌的种类、外植体类型、预培养和共培养时间、培养基中激素浓度均影响毛状根的转化率。毛状根经高压纸电泳检测显示表达冠瘿碱。毛状根中紫杉醇经超临界CO2法提取及硅胶柱色谱法分离提纯,采用高效液相法分析显示其纯度可达到98%。结论:发根农杆菌诱导南方红豆杉产生的毛状根中可产生紫杉醇,可作为紫杉醇的主要来源。     

不同产地南方红豆杉枝叶的紫杉醇含量及其指纹图谱的比较分析

采用HPLC法对来源于6个产地(陕西周至和汉中;甘肃天水;安徽胡乐、聂家山和仙寓山)的12份野生南方红豆杉[ Taxus chinensis var.mairei( Lemée et Lévl.) Cheng et L.K.Fu]枝叶中的紫杉醇含量进行了比较分析,并对不同产地南方红豆杉指纹图谱的相似度进行了比较和特征指纹图谱的构建.结果表明:不同产地南方红豆杉枝叶中紫杉醇的含量有明显差异,来源于陕西和甘肃的枝叶样品中紫杉醇含量明显高于来源于安徽的样品,以产自陕西周至的枝叶样品中紫杉醇含量最高(0.019 3 mg·g-1).各样品的指纹图谱均有12个共有峰,其中9号共有峰的保留时间(32.75 min)与紫杉醇标准品一致,被确定为南方红豆杉指纹图谱的参照峰(s).各共有峰相对保留时间的RSD值均低于1％,但相对峰面积的RSD值均高于40％,说明各样品共有峰的保留时间稳定,但相对含量差异较大.除来源于安徽聂家山的2个样品外,其他样品的相似度值均在0.8以上,说明各样品间指纹图谱的相似度较高.根据12个样品的指纹图谱建立了南方红豆杉枝叶的特征指纹图谱,可用于南方红豆杉的鉴定及质量控制.由测定结果推测:不同产地南方红豆杉枝叶中紫杉醇含量的差异可能与生长环境的差异有关.     

不同林龄南方红豆杉人工林细根结构及C和N含量比较与相关性分析

对不同林龄南方红豆杉也Taxuschinensisvar.mairei（LemeeetL＆#233;vl.）ChengetL.K.Fu页人工林不同等级细根的结构参数及C和N含量进行了比较,并分析了细根结构参数与C和N含量的相关性。结果显示：不同林龄南方红豆杉Ⅰ-吁级细根的根直径、比根长（SRL）和比表面积（SSA）均有差异,6、7和8a植株细根的平均直径分别为1.073、1.815和1.734mm,平均SRL分别为14.09、12.88和14.12m·g-1,平均SSA分别为54.93、45.85和50.72cm2·g-1;随根序等级提高,同龄植株细根的SRL和SSA均依次降低、根直径则逐渐增大,且总体差异显著（P〈0.05）;总体上,除Ⅰ级细根外,7a植株各级细根的SRL和SSA均最小;6a植株各级细根的直径均最小。各林龄植株细根的根尖密度和分叉数无显著差异（P〉0.05）,但均以6a植株最大。细根干质量以6a植株最低、7a植株最高,且差异显著。随根序等级提高,细根C含量逐渐增加、N含量则逐渐降低,同龄植株Ⅰ-Ⅴ级细根的C和N含量总体上差异显著;各级细根中,7a植株的C含量均最高、8a植株的N含量均最低;6、7和8a植株细根的平均C含量分别为454.41、501.90和441.55mg·g-1,平均N含量分别为12.63、11.99和5.88mg·g-1。各林龄植株细根的C含量与细根直径和干质量均正相关,与SRL、SSA和根尖密度均负相关;N含量与细根直径均负相关,与SRL、SSA和根尖密度均正相关;此外,N含量与干质量以及C和N含量与分叉数的相关性均无规律性。研究结果表明：树龄对南方红豆杉细根直径影响较大,而不同序级细根的结构差异更明显。     

南方红豆杉内生真菌的多样性与群落结构

从南方红豆杉480个针叶与枝条组织块中分离到628株内生真菌,根据形态特征和ITS序列鉴定为28属43个分类单元.其中,包括10种丝孢菌、20种腔孢菌、12种子囊菌和1种未知真菌,茎生拟茎点霉为优势种;根据相对频率,链格孢、出芽短梗霉、博宁刺盘孢、盘长孢状刺盘孢、黑附球菌、Fungal sp.、砖红镰孢、围小丛壳、Magnaporthales sp.、稻黑孢、斑点拟盘多毛孢、小孢拟盘多毛孢、Peyronellaea glomerata和Xylaria sp.1等在南方红豆杉中比较常见.南方红豆杉受到内生真菌侵染的程度较高,81%的组织有内生真菌存在,其资源丰富并具有较高的物种多样性;内生真菌分布受组织性质影响,南方红豆杉针叶中内生真菌的定植率、丰富度、多样性明显低于枝条,枝条间内生真菌组成比针叶与枝条间更加相似,表现出组织偏好性或专一性;组织年龄影响内生真菌的群落结构,随着南方红豆杉枝条组织年龄的增长,内生真菌的定植率、丰富度、多样性均表现出逐渐增加的趋势.系统研究南方红豆杉内生真菌的多样性与群落结构,阐明内生真菌在植物组织中的分布规律,可以为南方红豆杉内生真菌的开发利用提供基础资料和科学依据;探讨病原真菌在健康植物组织中的存在情况,对于南方红豆杉的植物资源保护具有积极意义.     

南方红豆杉丛枝菌根(AM)的研究

研究了南方红豆杉根部丛枝菌根真菌(AMF)侵染情况、菌根形态结构以及根际土中AMF孢子的种类与数量.结果显示:南方红豆杉可与AMF形成典型的丛枝-泡囊型菌根,侵染率在71.2%~94.4%,但是历山、蟒河自然保护区的侵染强度优于人工栽培区;在南方红豆杉根际土中共分离鉴定出5种AMF,无梗囊霉属1种、球囊霉属4种,分别是:光壁无梗囊霉、地表球囊霉、地球囊霉、缩球囊霉、明球囊霉,其中光壁无梗囊霉为优势种;南方红豆杉的根由表皮、外皮层、内皮层、中柱组成,AMF只侵染表皮层、内皮层,不能侵染中柱.这为将来利用AMF接种技术进行南方红豆杉的繁殖、移植栽培以及紫杉醇的积累等研究提供了理论依据.     

南方红豆杉细胞双液相培养中强化紫杉醇生产的研究

研究了南主红豆杉(Taxuschinensisvar.maireiChengetFu)细胞双液相培养中前体饲喂和混合糖源作为生产培养基糖源对细胞生长和紫杉醇合成的影响。结果表明,前体饲喂(苯丙氨酸、苯甲酰胺和醋酸钠)或混合糖(麦芽糖和蔗糖)作为生产培养基糖源对南方红豆杉细胞单液相培养、更重要的是对其双液相培养的紫杉醇产量提高有显著促进作用,而且前体饲喂和混合糖源的协同作用对其双液相培养的紫杉醇产量提高有进一步的促进作用。与对照组(蔗糖作为糖源和无前体的单液相培养)相比,在南方红豆杉细胞双液相培养中,第10天加入前体,第11天加入混合糖源,紫杉醇产量提高4倍多     

Study on Enhanced Production of Taxol from Taxus chinensis var. mairei in Biphasic-liquid Culture

The effects of precursor feeding and mixed sugar supplements on the growth and taxol production of Taxus chinensis var. mairei Cheng et Fu in the biphasic-liquid culture were studied. Precursor feeding (phenylanine, benzamide and sodium acetate) and mixed sugars (maltose and sucrose) resulted in significant increase of taxol production not only in the monophasic-liquid culture but also in the biphasic-liquid culture of T. chinensis var. mairei. The synergistic function of precursor feeding on day 10 and mixed sugars on day 11 in the biphasic-liquid culture revealed more significant increase of taxol production, which was four times that of the control (the monophasic-liquid culture without precursors or mixed sugars).