海岛棉几丁质酶基因GbCHI的克隆与功能分析

几丁质酶是植物主要的病程相关(PR)蛋白之一。前期工作中利用比较蛋白质组学方法, 从海岛棉7124根部蛋白中分离到一个IV型几丁质酶(GbCHI)。文章通过同源克隆获得了海岛棉GbCHI基因的cDNA序列, 并对该基因的表达特征及其蛋白的抑菌功能进行了分析鉴定。qRT-PCR实验结果表明GbCHI基因在棉花根、茎、叶、花和胚珠中均有表达, 其表达受大丽轮枝菌、水杨酸(SA)、乙烯(ACC)和茉莉酸(JA)诱导; 亚细胞定位分析显示GbCHI蛋白主要分布在细胞膜上; 体外抑菌实验证明GbCHI蛋白能显著抑制大丽轮枝菌孢子的萌发和菌丝的生长。这些研究结果为了解GbCHI的功能及其在抗黄萎病棉花分子育种中的应用提供了实验依据和思路。     

海岛棉类黄酮代谢通路相关基因的克隆及序列分析

本研究以前期的转录组和荧光定量筛选为基础,以海岛棉品种06-146为材料,通过RT-PCR克隆海岛棉类黄酮代谢通路关键基因。利用在线软件分析相关蛋白的理化性质及功能结构域,并比较相关蛋白在不同物种之间的同源,构建相关蛋白的系统发育进化树。分析表明GbCHI、GbDFR和GbTT7的CDS全长分别为681 bp、1 020 bp和1 593 bp。除GbTT7外,GbCHI和GbDFR为酸性蛋白。除GbCHI外,GbTT7、GbDFR均为稳定蛋白。GbCHI、GbDFR和GbTT7均为亲水蛋白。GbDFR,GbTT7在N端存在两个和一个跨膜区。Gb CHI属于查尔酮合酶家族。GbTT7属于细胞色素P450蛋白酶家族,GbDFR属于SDR家族,且这两个基因与水稻亲缘关系较近,与亚洲棉、雷蒙德氏棉和陆地棉亲缘关系较远,推测与海岛棉枯萎病抗性相关,为类黄酮代谢通路关键基因在海岛棉抗病育种中的应用提供理论依据。     

几丁质酶基因表达载体pET-chiB的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达

几丁质酶在降解几丁质的过程中起着重要作用,目前人们已从不同微生物体中分离并克隆出了多种几丁质酶基因。实验以pET-22b( )为载体,利用从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)克隆出的chiB基因,构建出原核生物表达载体pET-chiB。通过表达载体pET-chiB的诱导表达,实验结果显示该基因表达的蛋白为可溶性蛋白,其分子量约为52 kD。利用不同参数包括时间、IPTG浓度和温度诱导表达载体pET-chiB表达并对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示其诱导表达的最佳参数分别为4 h,0.5 mmol/L和25℃。这些结果为几丁质酶基因的进一步研究和几丁质酶工程菌生产奠定了良好的工作基础。     

桑氏链霉菌几丁质酶ChiKJ40基因的克隆表达及其抑菌作用

【背景】目前关于桑氏链霉菌(Streptomyces sampsonii)生防基因的研究不多,仅从其基因组中克隆了2个几丁质酶基因片段,其单个几丁质酶的完整基因序列相关研究未见报道。【目的】克隆S.sampsonii KJ40的几丁质酶基因Chi KJ40并进行原核表达,纯化重组蛋白并研究其抑菌作用。【方法】采用PCR扩增法从S.sampsonii KJ40中克隆几丁质酶基因Chi KJ40,连接到表达载体p ET-32a,导入Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达。使用His标记蛋白质微量纯化试剂盒对重组几丁质酶进行纯化,Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定粗酶液和纯化酶液的浓度,几丁质酶试剂盒测定粗酶液和纯化酶液的几丁质酶活性。观察重组几丁质酶对桉树焦枯病菌(Cylindrocladium scoparium)、栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、链格孢菌(Alternaria alternate)、紫丝核菌(Rhizoctonia violacea)几种致病真菌的抑菌作用。【结果】Chi KJ40基因(登录号为MF434484)在E.coli中经IPTG诱导表达,获得42 k D的重组几丁质酶,不同浓度IPTG在37°C诱导3 h,蛋白产量无明显变化。0.2 mmol/L IPTG 16°C诱导过夜,重组几丁质酶主要以可溶性形式存在于上清,小部分以包涵体存在于沉淀中。粗酶液几丁质酶活性为0.080 U/m L,酶比活力为0.041 U/mg,纯化酶液几丁质酶活性为0.046 U/m L,酶比活力为0.115 U/mg,纯化倍数为2.8,酶活回收率为57.5%。重组几丁质酶处理后,C.scoparium、C.parasitica和A.alternata菌丝细胞出现分节、膨胀,R.violacea菌丝溶解且部分被破坏成碎片。【结论】Chi KJ40基因的研究补充了S.sampsonii的生防背景,为几丁质酶基因找到了新的来源,并为其应用奠定了理论基础。     

转几丁质酶基因防植物病害研究:进展、问题与展望

综合评述了近几年转几丁质酶基因防植物病害研究中的发现与进展：（１）至少３１种病原真菌（含变种和专化型）可诱导植物几丁质酶,（２）据称已提纯的植物几丁质酶对立枯丝核菌等真菌呈现了体外抑菌活性;（３）一些生防细菌的防病作用依赖于其几丁质酶基因的存在;（４）数种植物几丁质酶基因和一种细菌几丁质酶基因已被转入水稻、烟草、番茄等植物,一些转基因株系抗病性显著增强;（５）粘质沙雷氏菌的一种几丁质酶基因已被转入荧光假单胞菌和根瘤菌中,转基因细菌对立枯丝核菌有显著抑制作用。就几丁质酶抑菌谱、转基因的策略和研究中存在的疑点进行了分析讨论。建议今后的研究方向应集中在以下几方面：（１）加速转几丁质酶基因或几丁质酶基因与其它基因组合的植物实用化;（２）进一步研究不同基因组合的增效作用及增效机理;（３）查明个别几丁质酶基因的抑菌谱及选择性抑菌机制;（４）转几丁质酶基因或与其它基因的组合于植物内生细菌。     

海岛棉WRKY转录因子的全基因组鉴定及响应黄萎病菌侵染的表达分析

WRKY蛋白是植物中一类重要的转录因子,其在很多生物过程中都发挥有重要作用。目前,关于海岛棉(Gossypium barbadense L.)WRKY转录因子的研究相对较少。本研究利用生物信息学方法在海岛棉基因组中鉴定出180个WRKY转录因子(GbWRKY)。根据基因结构及系统进化关系,可将GbWRKY基因分为3组(I～III),II组又可细分为5个亚组(IIa～IIe)。GbWRKY基因在染色体上分布不均匀。基因重复事件分析表明,全基因组复制及区段重复事件是GbWRKY基因数量增多的主要原因。表达分析发现,有61个GbWRKY基因在黄萎病菌(Verticillium dahliae)侵染条件下呈现差异表达,表明它们在黄萎病菌胁迫应答过程中发挥作用。本研究结果揭示了海岛棉WRKY转录因子的结构、进化及表达特征,为进一步研究棉花WRKY基因的功能提供了理论指导。     

粘质沙雷氏菌几丁质酶基因的研究进展

几丁质酶具有降解几丁质的作用,其降解产物氨基寡糖和几丁低聚糖在农业、食品、医药等领域具有重要的应用价值和广泛的应用前景。自然界中多种微生物可以产生几丁质酶,而其在细菌体内的合成受精密调控。粘质沙雷氏菌作为一种高产几丁质酶的菌种,在农业生防领域具有很大的应用潜力。本综述从粘质沙雷氏菌几丁质酶基因的分类和结构特征、几丁质酶基因克隆、表达和调控以及几丁质酶的应用等方面论述了粘质沙雷氏菌几丁质酶基因的研究进展,为粘质沙雷氏菌几丁质酶基因和功能蛋白的利用提供理论基础。     

金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae HN1)几丁质酶基因的克隆及高效表达

几丁质酶是昆虫病原真菌金龟子绿僵菌致病力的主要因子之一。本实验用RT-PCR方法,从本实验室分离筛选到的高毒力金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae HN1中,扩增得到几丁质酶基因全长,此基因全长为1275bp,登录号为DQ011865,经Blastn分析此基因序列与M. anisopliae E6的chi1基因（AF02749）同源率为96% 。以pET-22b(+)为基础载体,构建pET-chi重组表达载体,在大肠杆菌（Escherichia. coli ）BL 21中进行表达。经SDS-PAGE分析,获得了42kDa大小的重组目的蛋白,目的蛋白占表达总蛋白含量的63.3%。菌体经冷冻与超声波破碎后,按DNS法可测得几丁质酶的活性。     

甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA7的表达与结合活性分析

几丁质脱乙酰酶(Chitin deacetylase,CDA)是昆虫几丁质代谢酶系中的重要组分,是害虫防治的重要靶标。通过RT-PCR技术克隆得到编码甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶secda7基因(Gen Bank登录号为MG604929),该基因长1 431 bp,包含开放阅读框长1 134 bp,SeCDA7蛋白的预测分子量分别为43.156 k D。结构域分析显示,SeCDA7具有一个多聚糖乙酰基转移酶催化区,属于第Ⅴ类CDA蛋白。分别构建了原核和真核重组表达载体,利用大肠杆菌和Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统转染Sf9昆虫细胞,成功表达了SeCDA7蛋白,纯化SeCDA7蛋白并分析几丁质结合活性,结果表明SeCDA7蛋白具有几丁质结合活性;荧光定量PCR结果显示secda7基因主要在中肠组织表达。本研究实现了甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶基因secda7的外源表达,并鉴定出SeCDA7蛋白具有几丁质结合活性,为深入探究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶的生理功能提供了理论依据。     

高效大丽轮枝菌(Verticillium dahliae) 基因敲除体系的构建

[目的]为了深入研究大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)致病基因的功能,构建高效大丽轮枝菌基因敲除体系.[方法]融合PCR构建基因敲除载体;利用农杆菌介导法转化大丽轮枝菌;使用在T-DNA之间加入致死基因的双元载体,使T-DNA随机插入转化子在添加5-氟脱氧尿苷的培养基上不能存活,实现对随机插入转化子的"反向筛选".[结果]对大丽轮枝菌腺嘌呤合成酶基因和几丁质合成酶基因进行基因敲除验证,基因敲除转化子在总转化子中的比例分别达到87%和44%.[结论]成功构建大丽轮枝菌高效基因敲除体系,为大丽轮枝菌致病基因的功能验证提供了技术平台.     

Proteomic analysis of the sea-island cotton roots infected by wilt pathogen Verticillium dahliae

Verticillium wilt of cotton is a vascular disease mainly caused by the soil-born filamentous fungus Verticillium dahliae. To study the mechanisms associated with defense responses in wilt-resistant sea-island cotton (Gossypium barbadense) upon V. dahliae infection, a comparative proteomic analysis between infected and mock-inoculated roots of G. barbadense var. Hai 7124 (a cultivar showing resistance against V. dahliae) was performed by 2-DE combined with local EST database-assisted PMF and MS/MS analysis. A total of 51 upregulated and 17 downregulated proteins were identified, and these proteins are mainly involved in defense and stress responses, primary and secondary metabolisms, lipid transport, and cytoskeleton organization. Three novel clues regarding wilt resistance of G. barbadense are gained from this study. First, ethylene signaling was significantly activated in the cotton roots attacked by V. dahliae as shown by the elevated expression of ethylene biosynthesis and signaling components. Second, the Bet v 1 family proteins may play an important role in the defense reaction against Verticillium wilt. Third, wilt resistance may implicate the redirection of carbohydrate flux from glycolysis to pentose phosphate pathway (PPP). To our knowledge, this study is the first root proteomic analysis on cotton wilt resistance and provides important insights for establishing strategies to control this disease.     

Overexpression of GhPFN2 enhances protection against Verticillium dahliae invasion in cotton

Growing evidence indicates that actin cytoskeleton is involved in plant innate immune responses,but the functional mechanism remains largely unknown.Here,we investigated the behavior of a cotton profilin gene(GhPFN2) in response to Verticillium dahliae invasion,and evaluated its contribution to plant defense against this soil-borne fungal pathogen.GhPFN2 expression was up-regulated when cotton root was inoculated with V.dahliae,and the actin architecture was reorganized in the infected root cells,with a clear increase in the density of filamentous actin and the extent of actin bundling.Compared to the wild type,GhPFN2-overexpressing cotton plants showed enhanced protection against V.dahliae infection and the actin cytoskeleton organization in root epidermal cells was clearly altered,which phenocopied that of the wild-type(WT) root cells challenged with V.dahliae.These results provide a solid line of evidence showing that actin cytoskeleton reorganization involving GhPFN2 is important for defense against V.dahliae infection.     

海岛棉GbHyPRP1克隆及其转基因拟南芥抗黄萎病验证

在对黄萎病菌胁迫处理的海岛棉Pima 90-53根组织全长c DNA文库分析中,筛选到一个与黄萎病胁迫相关的杂合富含脯氨酸蛋白(hybrid proline-rich protein)基因,将其命名为Gb Hy PRP1。该基因c DNA序列全长1747 bp,开放阅读框945 bp,编码一个由314个氨基酸残基组成的蛋白,包含信号肽、N端富含脯氨酸域及C端Pollen Ole e I域。同源序列分析显示,Gb Hy PRP1与来自雷蒙德氏棉、陆地棉和亚洲棉的Hy PRP1蛋白序列相似性最高,分别为95.95%、93.87%和91.34%。q RT-PCR分析结果显示,受黄萎病菌胁迫后海岛棉根部Gb Hy PRP1表达显著下调。将Gb Hy PRP1基因克隆至植物超表达载体,农杆菌介导转化拟南芥获得转基因植株。病指统计分析表明Gb Hy PRP1过量表达显著降低了拟南芥对黄萎病的抗性。据此推测Gb Hy PRP1参与棉花抗黄萎病,可能是一个重要的负调控因子。     

Molecular characterization of an elicitor-responsive Armadillo repeat gene (GhARM) from cotton (Gossypium hirsutum)

Only a few Armadillo (ARM) repeat proteins have been characterized in plants where they appear to have diverse functions, including the regulation of defence responses. In this study, the identification, cloning and characterization of a gene, encoding an ARM repeat protein (GhARM), is described. GhARM exists as multiple copies in cotton, with an 1713 bp ORF encoding 570 amino acids. The predicted protein contains three consecutive ARM repeats within an Armadillo-type fold, with no other distinguishing domains. Sequence alignments and phylogenetic analysis revealed that GhARM has a high homology with other ARM proteins in plants. The predicted three dimensional model of GhARM displayed a characteristic right-handed superhelical twist. In silico analysis of the promoter sequence revealed that it contains several defence- and hormone-responsive cis-regulatory elements. Expression of GhARM was significantly down-regulated in response to treatment with a V. dahliae elicitor suggesting that GhARM may function as a negative-regulator of cotton defence signalling against V. dahliae. To date, GhARM is the only ARM repeat gene that has been completely sequenced and characterized in cotton.     

天麻抗真菌蛋白基因(gafp)转化彩色棉的研究

天麻抗真菌蛋白(gastrodia antifungal protein简称GAFP)是从我国传统中药天麻(Gastrodia elata B1．)中分离到的一种具有广谱抗真菌活性的蛋白质,它对许多植物真菌病包括棉花枯萎病、黄萎病等的致病菌离体具有很强的抑制作用,因此,在植物抗真菌病基因工程上有很重要的应用价值。本研究通过花粉管通道法,将GAFP的基因．gafp转入3个新疆彩色棉品种中,通过田间抗病筛选和分子检测,得到了高抗黄萎病的转基因植株,两株Southem杂交阳性植株LB-5-8和ZB-1—49对黄萎病表现整株免疫。RT-PCR的结果显示,LB-5-8和ZB-1—49中均有gafp的正确转录;离体的抑菌实验也表明,它们的蛋白粗提物对棉花黄萎病致病菌离体有明显的抑制,表明了gafp在转基因植株中的正确表达,翻译的产物具有活性。经过进一步选育和扩繁,发现转基因彩色棉后代具有稳定的、较强的抗黄萎病能力,本研究为通过植物抗病基因工程的方法防治棉花黄萎病提供了一条新的途径。     

天麻抗真菌蛋白基因(gafp)转化彩色棉的研究

天麻抗真菌蛋白（gastrodia antifungal protein简称GAFP）是从我国传统中药天麻（Gastrodia elata Bl.）中分离到的一种具有广谱抗真菌活性的蛋白质,它对许多植物真菌病包括棉花枯萎病、黄萎病等的致病菌离体具有很强的抑制作用,因此,在植物抗真菌病基因工程上有很重要的应用价值。本研究通过花粉管通道法,将GAFP的基因gafp转入3个新疆彩色棉品种中,通过田间抗病筛选和分子检测,得到了高抗黄萎病的转基因植株,两株Southern杂交阳性植株LB-5-8和ZB-1-49对黄萎病表现整株免疫。RT-PCR的结果显示,LB-5-8和ZB-1-49中均有gafp的正确转录;离体的抑菌实验也表明,它们的蛋白粗提物对棉花黄萎病致病菌离体有明显的抑制,表明了gafp在转基因植株中的正确表达,翻译的产物具有活性。经过进一步选育和扩繁,发现转基因彩色棉后代具有稳定的、较强的抗黄萎病能力,本研究为通过植物抗病基因工程的方法防治棉花黄萎病提供了一条新的途径。