冰核微生物中冰核基因重复序列PCR分析

在本试验的条件下,Pseudomonoas svringae inaZ基因产生的蛋白的主要重复基元的编码区：5’－GCCGGTTATGGCAGCACGCTGACC－3’序列既在冰核真菌、细菌中存在,也在非冰核真菌、细菌中存在,即冰核细菌、真菌和非冰核细菌、真菌都有扩增产物,并且产物呈多态性,同一个种不同菌株间也呈多态性,说明该引物不适合用于鉴定真菌、细菌中冰核基因是否存在,也不能用于区分冰核真菌和非冰核真菌以及分区冰核细菌和非冰核细菌,更不能根据其扩增片段的量和大小说明冰核真菌、细菌冰核活性的强弱。     

冰核细菌及冰核基因的应用研究进展

引起水由液态变为固态的物质称为冰核或成核剂。冰核种类繁多,目前已发现4属23种或变种的细菌、4属11种或变种的真菌和1种病毒,它们都具成冰活性。细菌冰核是一类蛋白质,也称冰蛋白,由细菌冰核基因编码。作为生物冰核领域的研究重点,冰核细菌的研究已涉及到促冻杀虫、防霜冻、植物病害等多个领域;同时冰核细菌已成功地应用于人工降雪、制冷和高敏检测等方面,具有广阔的应用前景。主要对冰核细菌的应用研究现状和发展进行综述。     

冰核细菌Erwinia ananas 110冰核基因克隆和序列分析*

从作者自行分离的冰核细菌(Erwinia ananas 110)中克隆到我国第1个细菌冰核基因,并完成其序列测定和分析。所克隆基因编码区全长3921bp,编码1306aa,氨基酸序列明显分为3个区即N-端(161aa)、C-端(41aa)的单一序列区和中部的高度重复序列R区(1104aa),以16氨基酸为重复单元的R区占整个编码序列的84.5％。序列分析表明我们所克隆的基因为一个新冰核基因,将其命名为iceA,该基因已在GenBank上登录,登录号为:AF387802。     

一种新型的报告基因—冰核基因

冰核基因 (ＩｃｅＮｕｃｌｅａｔｉｏｎＡｃｔｉｖｅｇｅｎｅ ,ＩＮＡｇｅｎｅ)是从冰核细菌中克隆的编码冰核蛋白的基因 ,它编码的冰核蛋白具有很强的冰核活性。当ｉｎａ基因与目的基因一起转入生物体后 ,可以通过冰核活性的测定来检测目的基因是否表达。冰核基因与通常的报告基因有着根本意义上的不同 ,它对信号的检测不是由于酶的催化反应 ,而是一种物理过程 (水的液 固状态的改变 )。ｉｎａ基因克服了其它报告基因的一些缺点 ,扩大了报告基因应用范围[1] 。现在 ,已经有很多研究植物 细菌相互作用的实验室应用ｉｎａ基因作为报告基因[4]…     

冰核细菌表达冰核蛋白特性的研究

选用１００２５Ａ和ＱＦ－９５－Ｆ１９两株分离自杨树的冰核活性细菌,探讨了两株菌不同生长阶段与它们冰核活性表达的特性。实验结果显示,冰核活性细菌在ＭＰＤＡ培养液中表达冰核蛋白的特性及活性与细菌浓度、菌龄以及培养的环境条件相关,两株菌在表达冰核活性时对培养基的营养组分没有表现出特殊的要求。同时还进一步阐明了不同生长温度冰核活性细菌对冰核蛋白表达的影响。     

冰核真菌研究进展

水在０℃以下仍未结冰的现象称为水的过冷却作用,小体积纯净水的过冷却温度可接近－４０℃。引起水从液态向固态转变的物质称冰核,不同种类冰核催化活性差异很大,非生物冰核可在－１０℃左右诱发小体积水结冰,而自然界中活性最强的冰核来自生物体,已报道某些细菌（如Pseudomonas syringae和Erwinia hericola的一些菌株）可产生在－１℃～－２℃下催化水结冰的冰核。研究者将一些可以产生在－５℃以上具有冰核活性冰核的生物称为冰核生物。自１９７４年Ｍａｋｉ［１］首次从赤杨树叶中分离到在－２℃～－５℃下诱发植物结冰发生霜冻的…     

冰核细菌表达冰核蛋白特性的研究*

选用１００２５Ａ和ＱＦ－９５－Ｆ１９两株分离自杨树的冰核活性细菌,探讨了两株菌不同生长阶段与它们冰核活性表达的特性。实验结果显示,冰核活性细菌在ＭＰＤＡ培养液中表达冰核蛋白的特性及活性与细菌浓度、菌龄以及培养的环境条件相关,两株菌在表达冰核活性时对培养基的营养组分没有表现出特殊的要求。同时还进一步阐明了不同生长温度冰核活性细菌对冰核蛋白表达的影响。     

冰核细菌(Erwinia ananas 110)冰核基因克隆和序列分析

从作者自行分离的冰核细菌（Erwinia ananas110)中克隆到我国第1个细菌冰核基因,并完成其序列测定和分析,所克隆基因编码区全长3921bp,编码1306aa,氨基酸序列明显分为3个区即N-端（161aa),C-端（41aa)的单一序列区和中部的高度重复序列R区（1104aa)。以16氨基酸为重复单元的R区占整个编码序列的84.5%。序列分析表明我们所克隆的基因为一个新冰核基因,将其命名为iceA。该基因已在GenBank上登录,登录号为：AF387802。     

冰核活性细菌基因的研究进展及其应用

冰核活性细菌是一类可以诱导过冷水结冰而导致霜冻灾害的细菌,它已成为一种重要的生物资源获得广泛的研究与开发,在基础理论和应用研究方面取得了较大进展。近些年来,许多国家的学科研究者对于冰核基因的研究与开发开展了大量的工作。自1985年克隆出了第一个冰核基因后,目前已经从冰核细菌中克隆了8个冰蛋白基因并完成了测序。冰核活性细菌及基因资源具有广阔的研究开发的价值,且具有良好的应用前景。所以,对于冰核活性基因的结构特点及近年来的研究现状有个总体了解是很有必要的。本文主要介绍了冰核活性基因及其应用方面的研究进展情况。     

大麦黄矮病毒的冰核活性与作物霜冻的关

对大麦黄矮病毒(Barley Yellow Dwarf Virus,BYDV)的冰核活性,以及它的侵染与作物霜冻的关系进行了研究.利用人工摸拟霜箱,测试了接种BYDV的小麦等作物植株的霜冻温度,并用ELISA法检测了供试植株的病毒含量.结果表明,接种样品与对照相比,感病品种的霜冻温度升高1—2℃以上,抗病品种的霜冻温度变化不大.离体叶片测定结果表明,“中7902”的叶片中,病毒含量与霜冻温度成正相关,说明BYDV可以起到异源冰核(heterogeneous ice nuclei)的作用,它的侵染能影响作物的抗霜冻能力.用“Vali小液滴冻结法”检测提纯的BYDV,证明BYDV具冰核活性,从而首次发现病毒也能起到生物冰核的作用.     

冰核真菌削弱赤拟谷盗抗寒力的初步研究

赤拟谷盗Tribolium castaneum是不耐结冰的害虫,在冬季它通过降低过冷却点以避免结冰造成的致命伤害。冰核活性细菌能显著提高昆虫的过冷却点,使之在较高的零下温度发生结冰。试验证明冰核活性真菌也能显著提高赤拟谷盗的过冷却点。对照组平均过冷却点为-14.9℃。用10 g/L的冰核真菌制剂喷洒虫体,风干后测定,平均过冷却点提高到-4.8℃。用0.1 g/L处理后至少在7天内过冷却点保持较高。这些结果表明冰核真菌可能成为一种在冬季使用的、防治不耐结冰害虫的促冻杀虫剂。     

冰核真菌胞外冰核产生条件、成冰生物学特性及其分离纯化的研究

果糖和葡萄糖作碳源、硫酸铵作氮源、培养温度25℃以下、培养液初始pH5～7和少量通气都利于胞外冰核产生,最佳培养时间受培养温度和接种菌龄的制约,而低温处理、光照及添加丝裂霉素C和HNPA对胞外冰核产生无明显影响。胞外冰核耐热(40℃处理后仍保持较高活性),酸碱适应性强(pH2～13);温度50℃以上、蛋白酶K和高浓度脲处理可完全失活或严重破坏其冰核活性,表明蛋白是真菌胞外冰核的必需成分;胞外冰核溶液中盐浓度高于50mmol/L时,活性才受抑制。25%冰乙醇可有效沉淀真菌胞外冰核,同时又保持较高活性;分离纯化的初步研究显示真菌胞外冰核分子量很大,电荷组成和分布上不均一,所带净电荷为负。本研究加深了对真菌胞外冰核的认识,为进一步分离纯化奠定了基础。     

冰核真菌胞外冰核产生条件、成冰生物学特性及其分离纯化的研究

果糖和葡萄糖作碳源、硫酸铵作氮源、培养温度25℃以下,培养液初始pH5-7和少量通气都利于胞外冰核产生,最佳培养时间受培养温度和接种菌龄的制约,而低温处理,光照及加丝裂霉素C和HNPA对胞外冰核产生无明显影响。胞外冰核耐热（40℃处理后仍保持较高活性）,酸碱适应性强（pH2-13);温度50℃以上,蛋白酶K和高浓度脲处理可完全失活或严重破坏其冰核活性,表明蛋白和真菌胞外冰核的必需成分;胞外冰核溶液中盐浓度高于50mmol/L时,活性才受抑制。25％冰乙醇可有效沉淀真菌胞外冰核,同时又保持较高活性;分离纯化的初步研究显示真菌胞外冰核分子量很大,电荷组成和分布上不均一,所带净电荷为负,本研究加深了对真菌胞外冰核的认识,为进一步纯化奠定了基础。     

垃圾填埋场中厌氧真菌18S rDNA的PCR扩增及鉴定

采用机械破壁法直接从来自 7个不同地区的垃圾填埋场滤液样本中提取真菌DNA ,应用真菌通用引物NS1和NS8扩增 18SrDNA(约 180 0bp) ,多聚酶链式反应 (PCR)产物的琼脂糖凝胶电泳结果表明所有的样本均得到了扩增 ;以PCR产物作为模板 ,采用厌氧真菌Chytridiomycetes科的专用引物Chyt 719和Chyt 15 5 3进行二次PCR扩增 (约 85.7bp) ,该阳性扩增产物克隆和测序结果首次表明在食草动物瘤胃中存在的厌氧真菌Chytridiomycetes也存在于垃圾填埋场中 ,且为Neocallimastix属     

冰核真菌胞外冰核产生条件、成冰生物学特性及其分离纯化的研究*

果糖和葡萄糖作碳源、硫酸铵作氮源、培养温度25℃以下、培养液初始pH5～7和少量通气都利于胞外冰核产生,最佳培养时间受培养温度和接种菌龄的制约,而低温处理、光照及添加丝裂霉素C和HNPA对胞外冰核产生无明显影响。胞外冰核耐热(40℃处理后仍保持较高活性),酸碱适应性强(pH2～13);温度50℃以上、蛋白酶K和高浓度脲处理可完全失活或严重破坏其冰核活性,表明蛋白是真菌胞外冰核的必需成分;胞外冰核溶液中盐浓度高于50mmol/L时,活性才受抑制。25%冰乙醇可有效沉淀真菌胞外冰核,同时又保持较高活性;分离纯化的初步研究显示真菌胞外冰核分子量很大,电荷组成和分布上不均一,所带净电荷为负。本研究加深了对真菌胞外冰核的认识,为进一步分离纯化奠定了基础。     

普通小麦SSR和EST-SSR引物对冰草通用性的比较分析

选用定位于普通小麦7个部分同源群的534对SSR引物和351对EST-SSR引物分别对普通小麦品种‘Fukuho’和四倍体冰草‘Z559’的基因组DNA进行扩增,结果显示:有475对(89.0%)SSR引物和314对(89.5%)EST-SSR引物对‘Fukuho’能有效扩增,226对(42.3%)SSR和258对(73.5%)EST-SSR引物对‘Z559’能有效扩增,表明小麦EST-SSR对冰草的通用性明显高于SSR;扩增强带比率SSR和EST-SSR引物分别为76.1%、84.1%,说明小麦EST-SSR在冰草上扩增带的质量亦优于SSR。选择上述在‘Fukuho’和‘Z559’基因组DNA之间有多态性扩增且带谱清晰的SSR和EST-SSR引物各60对,对‘Fukuho’、‘中国春’、‘北京8号’和二、四、六倍体冰草‘Z804’、‘Z559’、‘Z1075’的基因组DNA再行PCR扩增,结果显示,40对(66.7%)SSR和22对(36.7%)EST-SSR引物在‘Fukuho’、‘中国春’和‘北京8号’间扩增产物表现多态性,且前者高于后者;50对(83.3%)SSR和52对(86.7%)EST-SSR引物在冰草‘Z804’、‘Z559’和‘Z1075’间扩增产物表现多态性,两者相当。通用性、多态性和扩增强带比率综合比较表明,普通小麦EST-SSR和SSR经筛选虽都能转用于冰草,但两者相比EST-SSR更优。     

基因重组的生物检测法

静冈大学农学部助教授露无慎二等和东京大学农学部助教授荒井综一样等利用冰核细菌的冰核活性,从1 ml溶液能简单地检测出10个以下的细菌数,这项工作已在11月东京召开的日本植物病理学会秋季关东会上发表.用于基因重组生物开放系风险评价的放射性探测法是由科学技术厅委托开发的.冰核活性包括冰核细菌的溶液在-3℃放置5分钟,根据溶液的结冰情况判断.但是,要用冰核活性检测细菌,能感度低也是问题.露无等构建了在1ac Z基因的多克隆部位插入冰核基因的PUC载体,转化大肠杆菌.而且添加IPTG诱导1ac Z基因的表达,可提高检测灵敏度.在37℃下培养5～6个小时,使菌株增殖,在1克土壤中检测出5.3个大肠杆菌.实际应用时必须核对有无自然界的冰核活性的阻碍剂.     

大肠杆菌galK基因与gPt基因在爪蟾卵母细胞中的表达

把含有E．Coil gal K基因和gpt基因的几种重组质粒显微注射到爪蟾(Xencpus Laevis)卵母细胞的核中,用淀粉凝胶电泳检测到了细菌基因的表达产物。E．Coli gal K基因和gpt基因在爪瞻卵母细胞中的表达依赖于SV40病毒早期启动子的存在,而小鼠β-珠蛋白启动子在爪蟾卵母细胞中缺乏活性。此外,增强子在爪蟾卵母细胞中对细菌基因的活性有较为明显的增强作用。     

冰核真菌的冰核活性及其种类鉴定

作者从1993年起至今,从已分离和搜集到的500多株真菌中筛选出在-5℃具有冰核活性的真菌6株,它们-5℃的冻滴率高低顺序为F9502（100%）=F9501（100%）＞F9401（96％）=AS3．494（96%）＞F9801（94%）＞F9802（92%）,结冰点高低顺序为F9502（-2．7℃）＞F9501（-3．4℃）＞F9401（-4.4℃）＞AS34594（-4.5℃）＞F9801（-4．7℃）＞F9402（-4．8℃）,以F9502菌株活性强而稳定。经鉴定确定：F9401和F9402菌株为FusartumSportFichioldesSherb．;AS3．4594菌株为FavenaceumSacc．;F9501和F9502菌株为F.gramlnearumSchwabe;F9801菌株为F．monilijormeSheldon。F．Sportrlchloides和F．graminearum作为冰核真菌未见报道。本结果为揭示冰核真菌与植物冻害关系及冰核真菌开发应用研究提供了菌种资源,有重要应用价值。     

冰核细菌生物学特性及其诱发植物霜冻机理与防霜应用

就国内外有关冰核细菌生物学特性及其诱发植物霜冻机理与防霜应用的研究进展作以概述。阐述了冰核细菌种类、分布、影响冰核活性的成冰因素,冰核活性等级划分、冰核细菌保存方法以及冰核细菌诱发植物霜冻机理;简介了冰核细菌分子生物学研究进展;药剂和生防菌能够防除植物上冰核细菌减轻或控制霜冻危害,并已取得成效,是防御植物霜冻的一条新途径。