PVDF膜在电印迹法中的应用

本文介绍的是聚偏二氟乙烯膜（Polyvinylidenedifluoride,PVDF）在电印迹法中的应用,即将蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电沪后的条带电转移到PVDF膜上,随着蛋白质的转移,蛋白质在凝胶上的相对位置将在膜上得到相对的反映,然后将膜上所需蛋白质条带切割下来,直接可以用于N－未端序列分析及总氨基酸组成分析。该方法无需做到蛋白质的完全纯化,所以方法简单快速,所需样品量极少。     

用有限酶切法分析蛋白质的氨基酸序列

报道了一个通过有限酶切蛋白质产生多肽片段的方法.蛋白质经单向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离和用考马斯亮蓝短暂染色后,切下所需的蛋白质带,将其放入另一个SDS-PAGE凝胶的样品槽内,在电泳过程中该蛋白质被蛋白酶如蛋白酶V8降解,所产生的多肽片段随之被分离.电泳结束后,将多肽片段电印迹至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜上.这些多肽片段从PVDF膜上切下后可以直接被用于分析氨基酸序列.该方法能广泛适用于分析一般蛋白质和N端被修饰蛋白质的氨基酸序列.     

尿液蛋白质组作为下一代生物标志物的潜力

生物标志物是与机体生理及病理生理状态相关的可监测到变化的生化指标,尿液不属于内环境,没有稳态机制,能够积累并反映机体生理状态的早期变化,有潜力辅助疾病的早期诊断和预后监测。得益于非侵入性的收集方式,尿液可以被连续、大量、重复收集并便捷、稳定地保存,且组分相对简单,易于分析,是理想的标志物研究样本。但临床尿液样本蛋白质组可能会受到生活习惯、用药情况等多种混杂因素的影响,而动物模型方便控制变量,可以最大程度减少混杂因素的干扰,并使得在疾病发生、发展极早期采集样本成为可能;此外,患者的疾病分期、分型、用药情况等信息不能被忽视,现有样本策略和分析方式有待优化,例如,对同一个人不同时期、不同状态(例如患病前后)的尿液样本进行前后对照是一种理想的分析方式,这种方式能够消除个体间差异性的影响,符合个性化、精准化医疗的趋势;在无自身对照样本的情况下,一对多的分析方法能够更好地体现个体与健康群体的差别,辅助未知疾病的诊断和鉴别。尿液大分子的膜保存方式使得临床样本的保存更加简单经济。尿液生物标志物领域研究的进步需要政策和伦理的支持、资金和人力长期持续的投入以及大样本、大数据的辅助。本文综述了尿液生物标志物的重要概念、理论思想、发展历程、研究现状、主要方法和技术以及未来展望等内容,期望能较为全面地展示尿液蛋白质组在生物标志物领域广阔的应用前景。     

膜分离后的儿茶色素染发性能研究

本文采用聚偏氟乙烯膜提纯天然儿茶色素,结果表明膜分离法具有较好的分离效果.考察了染色温度,时间,pH值及媒染剂浓度等对白色牦牛毛染色效果的影响.结果表明,天然儿茶色素对白色牦牛毛具有直接染色效果,可染成棕色系列.锌离子可使毛发颜色偏向栗子色,铁离子和铜离子可使毛发颜色偏向黑色.其中温度与媒染剂浓度是影响颜色的重要因素.     

甲型乙型肝炎病毒标记:全血清和滤纸血检测效果的直接比较

<正>将血清或血液制成滤纸血片,对于收集和贮存标本进行分析乙型肝炎病毒标记,既方便又经济。这种方法在大规模血清学调查上具有许多优点:不需要针头、注射器及试管,通过刺破手指或足跟(适用于婴幼儿)即可容易地收集到血液;此外,标本可被晾干并在室温下保存,所占空间小,便于转运。其缺点是:与应用全血清分析的结果相比,敏感性有所下降;当干燥血液溶于缓冲     

Ⅱ型单纯疱疹病毒感染细胞的扫描与透射电镜对比观察

以感染复数为3的 HSV—Ⅱ(333株)感染兔婴肾单层细胞,不同间隔时间取材作扫描(SEM)及透射电镜(TEM)观察。感染1小时后,SEM 下显示细胞表面有大量病毒颗粒吸附,颗粒均匀分布或积聚成簇,多数病毒颗粒有囊膜,少数无囊膜。感染2小时后,变化与上基本类似,但有少数细胞变园。感染4小时后,变园的细胞数量增多,在此种细胞的核周区及边缘区积聚有大量病毒颗粒,而核上区则仅见少量散在的病毒颗粒,感染16小时后,部分细胞表面出现大小及形状不规则的孔洞;部分细胞解体成碎片,在孔洞边缘及细胞碎片中,可见有囊膜及无囊膜的病毒颗粒。病毒感染1—2小时后,TEM 下可见有囊膜及无囊膜的病毒颗粒吸附于细胞表面,随后在细胞表面的凹陷及胞浆小泡中,亦可见到类似的病毒颗粒。感染4小时以内的细胞超微结构变化主要有:髓膜的形成,线粒体肿胀,粗面内质网腔扩张及染色质边聚。感染16小时后,细胞呈现严重的变性及解体,在细胞碎片中,亦可见到有囊膜及无囊膜的病毒颗粒。对病毒的吸附,穿入,释放等问题进行了讨论.     

尿液蛋白质组在膀胱癌临床诊治中的应用

膀胱癌是一种常见的泌尿系统疾病,尿细胞学检查与膀胱镜检查是膀胱癌的主要临床诊断手段,但尿细胞学检查敏感性较差,膀胱镜检查为侵入性检查,易给病人带来强烈的不适感;且膀胱癌具有易复发的特点,大部分患者必须面临频繁的检查,临床亟需发展舒适、准确的检查手段.尿液存储是膀胱的主要生理作用,尿液可以直接接触肿瘤实体,肿瘤分泌的一些蛋白质分子极可能进入尿液中,并且患者尿液样本便于足量多次收集.同时,蛋白质组技术以及尿液蛋白质组研究的快速发展,为我们利用尿液研究膀胱癌提供了便利的途径.本文系统总结了尿液蛋白质组研究的主要技术手段,重点关注膀胱癌尿液蛋白质组研究趋势和应用方向,以期为利用尿液蛋白质组研究膀胱癌提供助力.     

超滤膜分离纯化珊瑚藻溴过氧化物酶

利用超滤膜对珊瑚藻中溴过氧化物酶(EC 1.11.1.18,分子质量740kDa)进行分离纯化,对膜的截留分子质量、操作压力、起始蛋白质浓度、搅拌速率、pH、离子强度等条件进行了优化。超滤分离纯化最优条件为:截留分子质量为100kDa的聚偏氟乙烯(PVDF)膜,操作压力为0.02MPa,搅拌速率为600r/min,起始蛋白质浓度为0.1g/L,pH=6.0。对粗酶液先进行热沉淀纯化,再进行超滤纯化,溴过氧化物酶被纯化了21倍,比活为212U/mg,酶活回收率为96%。     

动物细胞培养及单克隆抗体

923633抗人6一丙酮酸一四氢媒咤一合酶的单克隆抗体的产生及该酶的免疚细胞化学定位〔英万Guzman,J.…f Bioehem.Biophys。Res.Commun一2902,182(2)。一510~516〔译自DBA,1992,11(7),92一04039〕 经离体免疫接种制备了抗人垂体6一丙酮酞一四氢蝶咤一合酶(PTPs)的单抗(MAbs)。用一种直接由SDS一PAGE点印到聚偏二氟乙烯膜上的抗原刺激脾细胞5天,然后以2:1的比率在PEG 400中与X63一Ags/653骨髓瘤细胞融合,在HAT培养基中选择杂种细胞,并通过ELISA筛选能产生专性抗体的杂交瘤。获得的MAbs在ELIsA中不仅与人PTPS发生交叉反应,而…     

蚯蚓纤溶酶新基因PV242的克隆与表达

从我国特有的双胸蚓属（Lumbricus bimastus）蚯蚓体内提取到一种有纤维蛋白平板溶解活性的蛋白质,采用聚偏二氟乙烯膜(PVDF)微量测序法测得蛋白质的N端氨基酸序列,依此设计简并引物,通过RT-PCR获得其对应cDNA.该cDNA全长888 bp,1～726位核苷酸对应读码框架(ORF),编码含242个氨基酸的成熟肽.终止子（TAG）位于cDNA的727～729位,其余核苷酸序列为3′端非编码区.成熟肽命名为蚯蚓纤溶酶PV₂₄₂.蛋白质预测得知蛋白质等电点为4.33,含组氨酸(His44)及丝氨酸 (Ser191)两个活性位点;蛋白质由两个结构域组成,表面有活性裂隙;该蛋白质属丝氨酸蛋白酶超家族胰蛋白酶类.经国际基因库等多种查询比较未见PV₂₄₂基因的报道,为首次发现的新基因,在国际基因库的输入号为GenBank AF109648.随后构建了pTrxFUS-PV₂₄₂重组质粒,并在大肠杆菌GI724中获得融合蛋白TrxA/PV₂₄₂的可溶性表达,采用离子交换层析法纯化表达蛋白,融合蛋白有纤维平板溶解活性.     

直组人嗜中性白细胞活化蛋白-1/白细胞介素-8的纯化与鉴定

本文利用SDS-PAGE及蛋白质电泳印迹技术,从带有相应表达质粒的重组大肠杆菌裂解液中,将所表达的重组人嗜中性白细胞活化蛋白-1/白细胞介素-8(NAP-1/IL-8)转移至聚偏二氟乙烯膜上,直接进行N-末端15个氨基酸的序列分析,从而确证该目标蛋白得到高效表达和正确加工。随后采用Bio-Gel P30凝胶过滤层析和Mono-S阳离子交换层析对重组人NAP-1/IL-8进行了分离纯化,纯化产品达到SDS-PAGE纯。利用琼脂糖平板法测定了纯化产品的嗜中性白细胞趋化活性,推算其比活为2.8×10~5U/mg蛋白。又利用SDS-PAGE测出重组NAP-1/IL-8的分子量约为8.5kD,但根据凝胶过滤层析的洗脱时间推定,在溶液中确实存在分子量稍大于14.4kD的NAP-1/IL-8二聚体。     

亲和素蛋白与含有生物素的支撑平面膜之间相互作用的研究

生物功能分子的二维有序化组装是分子工程学的重要内容,本文通过构建有生物素受体的人工模型膜,对亲和素与生物这一具有极强亲和力的系统之间的特异性相互作用的某些制约因素进行了探讨,应用ＬＢ膜技术结合激光椭圆偏振术和表面等离激元谱技术,较深入地研究了蛋白质与脂单层膜发发的非特异性吸附,特异性结合以及结合的侧向空间位阻效应,实验结果表明,膜表面电荷对非特异性吸附的速率有很大的影响,而对最终的蛋白质附量影响不     

中段尿在常温下保存时间对培养结果的影响研究

目的 探讨临床尿液标本不同放置时间对细菌培养结果的影响,明确尿液标本合理保存时间,加强对标本细菌培养前的保存时间控制.方法 随机选取114份患者尿液标本,比较其在新鲜尿液即刻培养结果和室温(22 ～25℃)的环境中各放置0.5、1、2、3、4和5h等不同时间点细菌培养结果的分离率差异,采用样本率与总体率(新鲜尿液培养的分离率)的差别检验(|u|和P)分析其是否具有统计学意义.结果 新鲜尿液即刻培养与放置0.5h培养结果分离率差异无统计学意义(38.6％);之后随放置时间延长分离率逐渐升高,2h接种标本分离率为43％,差异无统计意义(|u| =0.9489,P ＞0.05);放置3、4和5h后接种标本分离率分别为50.9％、55.3％和63.2％,呈显著增高(|u|值分别为2.627、3.586和5.446,P值均小于0.01).结论 在常温下不同的保存时间对培养结果有着重要影响,尤其在2h后影响更为显著.准确有价值的培养结果,与标本合理的存放时间有极大的关系,加强尿液培养前阶段的保存时间控制非常重要.     

亲和素蛋白与含有生物素的支撑平面膜之间相互作用的研究

生物功能分子的二维有序化组装是分子工程学的重要内容。本文通过构建有生物素受体的人工模型膜,对亲和素与生物素这一具有极强亲和力的系统之间的特异性相互作用的某些制约因素进行了探讨．应用ＬＢ膜技术结合激先椭圆偏振术和表面等离激元谱技术,较深入地研究了蛋白质与脂单层膜发生的非特异性吸附,特异性结合以及结合的侧向空间位阻效应．实验结果表明,膜表面电荷对非特异性吸附的速率有很大的影响,而对最终的蛋白吸附量影响不大;非特异性的吸附可以通过二阶阳离子的脱附而去除;受体蛋白质与配体间的特异性结合受到侧向空间位阻效应的制约．     

蛋白质组分析中蛋白质分步提取方法的建立

利用细胞裂解液充分溶解细胞蛋白质是成功进行蛋白质组分析的先决条件.尝试利用三步提取法,即以三种溶解性能不同的裂解液分步提取细胞中的蛋白质组,并分别进行二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2-D PAGE）分离.通过对2-D PAGE蛋白质图谱的比较,发现其与常规方法相比,具有蛋白质提取率高、双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)分辨率高等优点.     

发菜的显微及亚显微结构的观察

通过光学显微镜、扫描电镜和透射电镜的观察、了解到一条发菜原植体大约由数十万计的念珠状细胞所组成,其藻丝多为单链,但也发现有分枝现象。整个原植体包被着厚薄不均的胶质鞘,外观粗糙,沟稜状起伏,且多裂隙。念珠状细胞为典型的原核细胞。细胞壁有三层结构,中央为色浅的核质区,四周为细胞质区其中散布着大量膜层薄而散乱的类囊体,膜上附有大量 rRNA 和藻胆体颗粒。还发现有膜层密集形如指纹的小类囊体。在细胞质中还分布着结构颗粒,多角体、聚磷酸体等嗜锇物质结构.一般细胞都具有分裂能力,方式多为横缢,先是细胞壁逐渐向中央扩展,最后将母细胞分成两个子细胞.从异形胞的结构特征来看,主要功能是渡过恶劣环境以保存物种。     

符合大肠癌早期无创分子诊断要求的粪便DNA样本贮存条件考察

目的:考察在不同温度下储存时间和反复冻融对粪便中人基因组DNA含量的影响。方法:1.将粪便样本在室温、4℃、-40℃和-70℃条件下分别放置不同时间和-40℃条件下保存并反复冻融后,使用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒提取得到粪便DNA,通过实时荧光定量PCR体系对人KRAS基因定量确定人基因组DNA含量,评价粪便样本不同冻存条件对其中人基因组DNA含量的影响。2.将粪便DNA样本在4℃和-40℃条件下分别放置不同时间和-40℃条件下保存并反复冻融后,评价粪便DNA样本不同冻存条件下对其中人基因组DNA含量的影响。结果:1).粪便样本常温放置2小时,其中人基因组DNA即发生明显降解(P0.01),4℃可保存3天左右,-40℃可保存4周,-70℃可保存3个月以上,粪便反复冻融第3次,其中人基因组DNA降解具有统计学意义(P0.05)。2).粪便DNA 4℃可保存3天,-40℃可保存4周,粪便DNA反复冻融第4次,其中人基因组DNA降解具有统计学意义(P0.05)。结论:符合大肠癌早期无创分子诊断要求的粪便DNA贮存条件:粪便样本室温收集后尽快保存;短期可处理的粪便样本存放在4℃条件下(3天内);暂无法处理则存于-40℃(1个月内);粪便样本长期保存在-70℃条件下,可保存3个月。     

以SecA蛋白为“动力泵”的细菌Sec蛋白转运途径

细菌细胞中,三分之一的蛋白质是在合成后被转运到细胞质外才发挥功能的.其中大多数蛋白是通过Sec途径(即分泌途径secretion pathway)进行跨膜运动的.Sec转运酶是一个多组分的蛋白质复合体,膜蛋白三聚体SecYEG及水解ATP的动力蛋白SecA构成了Sec转运酶的核心.整合膜蛋白SecD,SecF和vajC形成了一个复合体亚单位,可与SecYEG相连并稳定SecA蛋白的膜结合形式.SecB是蛋白质转运中的伴侣分子,可以和很多蛋白质前体结合.SecM是由位于secA基因上游的secM基因编码的,可调节SecA蛋白的合成量,维持细胞在不同环境条件下的正常生长.新生肽链的信号肽被高度保守的SRP特异性识别.伴侣分子SecB通过与细胞膜上的SecA二聚体特异性结合将蛋白质前体引导至Sec转运途径,起始转运过程.结合蛋白质前体的SecA与组成转运通道的SecYEG复合体具有较高的亲和性.SecA经历插入和脱离细胞内膜SecYEG通道的循环,为转运提供所需的能量,每一次循环可推动20多个氨基酸的连续跨膜运动.     

核孔复合体

真核生物间期的细胞中,可以观察到由二层核膜围绕的细胞核。核膜不是一个完全封闭的膜体系,而是由内外二层核膜局部融合形成许多小孔,称为核孔,核孔及其周围的复杂结构统称核孔复合体(Nuclear pore complex,以下简称NPC),有时人们也把核孔作为NPC的同意词。NPC担负着细胞核与细胞质之间繁忙的运输大分子或颗粒物质的任务,而小分子和离子的通透主要是由核膜调节的。在快速生长的细胞中,每分钟要把约10~4个核糖体大小亚基从细胞核的核仁运到细胞质中以满足蛋白质合成的需要。在S期的细胞中     

胞间连丝：共质体运输的动态通道

胞间连丝作为一种细胞质结构将相邻的细胞连系起来而形成植物的共质体。胞间连丝通过调控许多离子和分子的共质体运输而广泛地参与植物的生命活动。胞间连丝的主要构成部分是细胞质膜、连丝小管、以及位于二之间的环层细胞质。这三都很容易在电子显微镜下观察到。细胞骨架的成分（肌动蛋白和肌球蛋白）起到稳定胞间连丝的作用。同时,钙结合蛋白可能具有调节间连丝功能的作用。在胞间连丝里,环层细胞质为大多数溶质提供共质体运输的通道,而有些 共质体运输则可能是通过连丝小管的内腔、连丝小管的壳层、甚或是细胞质膜来实现的。共质体可以细分为数个区块,它们各自允许不同大小的分子（从低于1000到高于10000道尔顿）通过。从发生上看,胞间连丝可以是初生的,也可以是次生的。前是伴随着新细胞壁的形成则产生的,而后则是在已有的细胞壁上产生的。胞间连丝的动态性质还表现在它们的频率是处于变化之中,这是由于组织或植物整体的发育和生理状态决定的。虽然共质体运输的基本形式是扩散,但胞间连丝对于某些离子和分子却是选择性的。在病毒感染细胞时,病毒的移动蛋白作用于胞间连丝的受体蛋白,结果,胞间连丝被显地扩张（其机理尚不清楚）。于是,病毒的移动蛋白连同与之结合在一起的病毒基因组进入毗邻的健康细胞。一些植物源性的蛋白质也能够通过胞间连丝来运输;推测其方式类似于病毒的移动蛋白。有些植物蛋白质本身就是信号分子,它们调节分化和其他活动。与此相反,还有一些植物蛋白质的共质体运输并不是通过特异的方式来实现的。