线粒体与细胞凋亡调控

细胞凋亡是一个受到一系列相关基因严格调控的细胞死亡过程。线粒体是细胞凋亡调控的活动中心。在凋亡因子的刺激下,线粒体释放出不同促凋亡因子如细胞色素C、Smac／Diablo等,激活细胞内凋亡蛋白酶Caspase。我们发现,活化后的Caspase可以反过来作用于线粒体,引发更大量线粒体细胞色素c的释放,构成细胞色素c释放的正反馈调节机制,从而导致电子传递链的中断、膜电势的丧失、胞内ROS的升高以及线粒体产生ATP功能的完全丧失。Bcl-2家族蛋白在细胞色素C释放和细胞凋亡调控中起关键作用。     

Ceramide induces release of mitochondrial proapoptotic proteins in caspase-dependent and -independent manner in HT-29 cells

In this study, the release of mitochondrial proapoptotic intermembrane space proteins induced by exogenous C2-ceramide in human colon carcinoma (HT-29) cell line was investigated. HT-29 cells were treated with 12.5, 25 and 50 μmol/L C2-ceramide in vitro. Flow cytometer was used to detect the mitochondrial membrane potential (△Ψm). Subcellular fractions were extracted by Mitochondrial/Cytosol Fractionation Kit after C2-ceramide treatment for 24 h. SDS-PAGE was used to determine the level of cytochrome c (Cyt c), high temperature requirement A2 (HtrA2) and second mitochondrial-derived activator of caspases (Smac) released from mitochondria, the expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) and caspase-3 for 24 h. The results showed that △Ψm began to decrease from 6 h after 25 and 50 μmol/L C2-ceramide treatment (P＜0.05) and cyclosporin A (CsA) could inhibit the collapse of △Ψm through regulating mitochondrial membrane permeability transition pore. There was no effect of C2-ceramide on the expression of Cyt c, HtrA2 and Smac in the total levels. 12.5, 25 and 50 μmol/L C2-ceramide could induce Cyt c, HtrA2 and Smac to release from mitochondria to cytosol and down-regulate the expression of XIAP (P＜0.05). Also there was expression of cleaved caspase-3 with C2-ceramide treatment. After the treatment with caspase inhibitor, C2-ceramide still induced the release of Cyt c and HtrA2, but Smac did not. Therefore, C2-ceramide could induce apoptosis of HT-29 cells through the mitochondria pathway. The release of Cyt c, HtrA2 and Smac from mitochondria did not occur via the same mechanism, the release of Cyt c and HtrA2 was caspase-independent and the release of Smac was caspase-dependent.     

缺氧诱导心肌细胞凋亡与Caspase-3激活及细胞内钙超载的关系

目的: 研究缺氧对心肌细胞Caspases的激活效应与细胞内钙的关系.方法: 将培养的心肌细胞暴露于95% N2/5% CO2混合气体培养室进行缺氧处理,缺氧0、30 min、1、3、6、12、24 h后,应用激光共聚焦显微镜检测缺氧早期心肌细胞胞浆游离钙的变化;应用细胞内钙螯合剂、Caspase-1与Caspase-3特异性抑制剂预处理心肌细胞后缺氧12 h,检测DNA片段化与Caspase-3活性;Western blot、RT-PCR方法分别检测细胞线粒体与胞浆中Cyt c蛋白的变化以及Caspase-3 mRNA表达的改变.结果: 缺氧后30 min心肌细胞胞浆游离钙即显著增高,1 h达到峰值.缺氧3 h线粒体Cyt c无显著变化,而胞浆中Cyt c开始增多,至缺氧12 h,线粒体中Cyt c仅见一弱阳性条带,而胞浆呈强阳性反应,缺氧24 h 线粒体中已不能检测到Cyt c.缺氧3 h心肌细胞Caspase-3 mRNA上调,在观察的24 h内持续处于高表达状态.分别应用Caspase-3抑制剂和细胞内钙螯合剂预处理心肌细胞后均可使心肌细胞Caspase-3活性降低并完全阻断DNA片段化发生,细胞内钙螯合剂与Caspase-3抑制剂联合应用使凋亡细胞百分率降低的程度比分别单独使用两者更明显.结论: 缺氧可致心肌细胞线粒体Cyt c释放至胞浆,导致Caspase途径激活,从而导致细胞凋亡.缺氧所致心肌细胞钙超载在时序上早于线粒体Cyt c释放与Caspase-3的激活,螯合细胞内钙可阻断缺氧诱导的Caspase-3激活,并拮抗心肌细胞凋亡的发生,因此细胞钙超载是启动线粒体Cyt c释放与Caspase-3激活的一个早期重要分子事件.     

MFN1介导的线粒体融合在心肌细胞凋亡中的作用研究

目的:探讨线粒体融合关键蛋白MFN1介导的线粒体融合在调控心肌细胞凋亡中的作用。方法:通过si RNA降低体外培养H9C2心肌细胞中MFN1的表达后,采用Western blot检测线粒体细胞色素c(Cyto c)释放及其下游凋亡效应分子Caspase9与Caspase3活性,流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)的产生情况,流式细胞术检测细胞凋亡的情况。结果:干扰MFN1可显著促进H9C2心肌细胞内细胞色素c由线粒体释放至胞浆,促进Caspase9与Caspase3的激活,增加细胞内活性氧ROS产生并提高细胞凋亡率(均P0.05)。结论:MFN1介导的线粒体融合可保护心肌细胞凋亡,其机制可能与抑制ROS产生与细胞色素C释放有关。     

山柰酚通过线粒体凋亡通路诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡的机制研究

本文旨在探讨山柰酚对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制作用及其可能的分子机制。用不同浓度的山柰酚处理细胞,CCK-8法检测山柰酚对MDA-MB-231和人正常乳腺上皮细胞MCF-10A活力的影响,倒置显微镜观察各组细胞形态变化,克隆形成法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位的改变,Western blot检测B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞色素C(Cyt C)和细胞周期蛋白D1(CyclinD1)的蛋白表达,比色法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9(Caspase-9)的活性。结果显示,山柰酚体外可显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖,诱导细胞凋亡,且对正常乳腺上皮细胞活力无影响,降低细胞线粒体膜电位,上调Bax、Cyt C的表达,下降Bcl-2和Cyclin D1的表达,增强Caspase-3、Caspase-9活性。结果表明,线粒体凋亡信号通路的激活是山柰酚诱导MDA-MB-231细胞凋亡的途径之一。     

线粒体凋亡途径的研究进展

线粒体凋亡途径是细胞凋亡的主要途径之一。是目前研究凋亡的热点,各种凋亡刺激信号通过BH3（Bcl-2homology domain3)-only蛋白引起Bax(Bcl-2-asslciated proteinX)蛋白移位到线粒体外膜并多聚化,形成膜通道,刺激线粒体释放细胞色素C（CytC)和Smac(second mitochondrial-derived activator of caspase),CytC通过Apaf-1因子的多聚化与胱天蛋白酶（caspases)-9形成凋亡小体,导致下游胱天蛋白酶的级联反应,而凋亡蛋白抑制因子（IAP）和Smac通过抑制和促进胱天蛋白酶的级联反应来调控细胞凋亡。     

Ceramide induces release of mitochondrial proapoptotic proteins in caspase-dependent and -independent manner in HT-29 cells

In this study, the release of mitochondrial proapoptotic intermembrane space proteins induced by ex-ogenous C2-ceramide in human colon carcinoma (HT-29) cell line was investigated. HT-29 cells were treated with 12.5, 25 and 50 μmol/L C2-ceramide in vitro. Flow cytometer was used to detect the mito-chondrial membrane potential (ΔΨm). Subcellular fractions were extracted by Mitochondrial/Cytosol Fractionation Kit after C2-ceramide treatment for 24 h. SDS-PAGE was used to determine the level of cytochrome c (Cyt c), high temperature requirement A2 (HtrA2) and second mitochondrial-derived ac-tivator of caspases (Smac) released from mitochondria, the expression of X-linked inhibitor of apop-tosis protein (XIAP) and caspase-3 for 24 h. The results showed that ΔΨm began to decrease from 6 h after 25 and 50 μmol/L C2-ceramide treatment (P<0.05) and cyclosporin A (CsA) could inhibit the col-lapse of ΔΨm through regulating mitochondrial membrane permeability transition pore. There was no effect of C2-ceramide on the expression of Cyt c, HtrA2 and Smac in the total levels. 12.5, 25 and 50 μmol/L C2-ceramide could induce Cyt c, HtrA2 and Smac to release from mitochondria to cytosol and down-regulate the expression of XIAP (P<0.05). Also there was expression of cleaved caspase-3 with C2-ceramide treatment. After the treatment with caspase inhibitor, C2-ceramide still induced the release of Cyt c and HtrA2, but Smac did not. Therefore, C2-ceramide could induce apoptosis of HT-29 cells through the mitochondria pathway. The release of Cyt c, HtrA2 and Smac from mitochondria did not occur via the same mechanism, the release of Cyt c and HtrA2 was caspase-independent and the re-lease of Smac was caspase-dependent.     

线粒体膜间隙蛋白在细胞凋亡中的作用

线粒体除了作为细胞内的“能量工厂”外,在控制细胞凋亡中起主导作用。细胞凋亡时,线粒体膜通透性增加,释放可溶性线粒体膜间隙蛋白质,进一步破坏细胞结构。在这些致死性蛋白质中,有些(cytc、Smac／DIABLO、Omi／HtrA2等)能够激活caspases,另一些(endo G、AIF、Omi/HtrA2等)则以非caspase依赖的方式发挥作用。多种线粒体因子参与细胞凋亡,强化了细胞器在凋亡控制中的核心作用。     

球孢菌素A和Bcl—2高表达对EGTA诱导HL—60细胞凋亡的影响

研究线粒体PT孔专一抑制剂环孢菌素A（CsA）和Bcl-2高表达对EGTA诱导HL－60细胞凋亡的影响。流式细胞仪检测凋亡峰、染色质凝聚的PI和Hoechst33342荧光双染观察、DNA梯状条带分析均表明,CsA明显促进EGTA诱导的HL－60细胞凋亡,而Bcl-2高表达完全阻断细胞凋亡的发生,借助荧光探针rhodamine123和CMXRos研究细胞凋亡过程线粒体△ψm下降,而Bcl-2高表达使HL－60细胞的线粒体△ψm提高了近1倍,并完全抑制EGTA诱导的线粒体△ψm下降。     

缺氧肺动脉平滑肌细胞中线粒体ATP敏感钾通道开放对细胞色素C的分布及细胞增殖的作用

为了探讨线粒体ATP敏感钾通道（mitochondrial ATP-sensitive K^＋channel,mito KATP）和线粒体膜电位（△ψm）在细胞缺氧信号转导中的作用以及对缺氧肺动脉平滑肌细胞中细胞色素C在细胞内的分布及细胞增殖的影响,本实验将人肺动脉平滑肌细胞进行常氧或24h缺氧培养,并将标本分为六组：（1）对照组;（2）mito KATP,开放剂diazoxide组;（3）mito KATP阻断剂5-HD组;（4）24h缺氧组;（5）24h缺氧＋diazoxide组;（6）24h缺氧＋5-HD组。利用激光共聚焦显微镜成像法检测△、ψm;线粒体／胞浆成分分离试剂盒（Bio Vision）分离线粒体和胞浆成分后,Western blot检测两者细胞色素C;Western blot检测细胞中caspase-9的蛋白表达量;MTT法及PI染色后流式细胞仪检测细胞增殖情况。结果显示：（1）diazoxide作用24h后,R-123荧光明显增强,胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显降低,caspase-9的蛋白表达显著减少,细胞增殖明显增多、凋亡减少,与正常对照组相比较,均P〈0．05;而5-HD作用24h与正常对照组比较,上述指标无明显变化（P〉0．05）。（2）缺氧24h组,结果与diazoxide组相似,R-123荧光明显增强,胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显降低,caspase-9的蛋白表达显著减少,细胞增殖明显增多、凋亡减少,与正常对照组相比较,均P〈0．05;24h缺氧＋diazoxide组与缺氧组相比较,R-123荧光明显增强,胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显降低,caspase-9的蛋白表达显著减少,细胞增殖明显增多、凋亡减少（P〈0．05）;而24h缺氧＋5-HD组与缺氧组比较,R-123荧光明显降低,胞浆细胞色素C与线粒体细胞色素C的比值明显升高,caspase-9的蛋白表达显著增加,细胞增殖明显减少、凋亡增多（P〈0．05）。上述实验结果提示,缺氧可以引起mito KATP,的开放以及△ψm的去极化,并进而抑制细胞色素C从线粒体释放到胞浆,抑制线粒体凋亡途径,从而参与并影响肺动脉高压的发生、发展。     

Smac/DIABLO在过氧化氢所致C2C12肌原细胞凋亡中的作用

为探讨Smac/DIABLO在过氧化氢 (H2 O2 )所致C2 C12 肌原细胞凋亡中的作用 ,采用Hoechst 3 3 2 58染色 ,观察H2 O2 (0 5mmol/L)处理C2 C12 肌原细胞不同时间后 ,细胞核形态学改变并计算凋亡核百分率 ,DNA抽提及琼脂糖电泳观察凋亡特征性梯状带 ,利用细胞成分分离后蛋白质印迹分析H2 O2 是否导致Smac/DIABLO从线粒体释放 ,采用Caspase检测试剂盒及蛋白质印迹分析Caspase 3和Caspase 9的活化 ,转染Smac/DIABLO基因 ,观察Smac/DIABLO过表达对H2 O2 所致的C2 C12 肌原细胞凋亡的影响 .结果表明 :H2 O2 处理 1h后 ,Smac/DIABLO从C2 C12 肌原细胞线粒体释放入胞浆 ,2h更明显 ;H2 O2 处理 4h后 ,Caspase 3和Caspase 9活化 ,12h达高峰 ;H2 O2 处理 2 4h后 ,C2 C12 肌原细胞显示特征性的凋亡形态改变 ,凋亡核百分率明显升高 ,DNA电泳出现明显“梯状”条带 .与单纯过氧化氢损伤组相比 ,Smac/DIABLO高表达的C2 C12 肌原细胞经过氧化氢损伤组的Caspase 3和Caspase 9的活化、凋亡核百分率的升高、“梯状”条带的出现均更明显 .结果表明 ,H2 O2 可导致Smac/DIABLO从C2 C12 肌原细胞线粒体释放 ,促进Caspase 9和Caspase 3的活化而促进细胞凋亡的发生     

外源H2O2对湖北海棠根系线粒体膜透性和细胞核DNA的影响

用0．024％（V／V）H2O2处理湖北海棠（Malus hupehensis Rehd．）实生苗根系,30min后,根系线粒体膜通透,陛明显增大,线粒体膜电位（△ψm）和线粒体内Cyt c／a吸光度比值下降;60min后,根系细胞核DNA发生片段化降解。经荧光染料吖啶橙染色后,可见H2O2处理60min以上的根系压片中出现了清晰致密的黄绿色荧光宽,呈现出细胞程序,陛死亡（PCD）的特征。     

胸腺细胞和细胞器水平的线粒体膜电势研究

以地塞米松(DEX)诱导小鼠胸腺细胞凋亡;利用PI和AnneXin V/PI流式细胞术分别检测细胞晚期和早期凋亡;利用JC-1和DiOC_6(3)/PI在细胞水平检测凋亡中线粒体膜电势(△ψm)变化：抽提线粒体,利用JC-1直接染色技术检测现存线粒体△ψm情况。实验结果显示,DEX显著诱导胸腺细胞早期和晚期凋亡,凋亡细胞主要来自G_0/G_1期;细胞水平可见DEX介导与△ψm相关的J-aggregate和DiOC_6(3)可染性降低,同时介导线粒体数量显著降低,6h细胞膜完整性无显著变化：单纯线粒体检测结果显示,多数线粒体维持正常△ψm。提示,DEX介导胸腺细胞凋亡中线粒体数量降低,现存线粒体多保持着正常△ψm以维持凋亡过程细胞能量供给。     

HIV Vpr蛋白诱导细胞凋亡研究进展

Vpr蛋白是HIV的一个辅助蛋白,可以诱导多种细胞的凋亡。目前的研究表明Vpr蛋白引起细胞凋亡主要是通过线粒体途径实现的。Vpr蛋白通过直接而且特异地与结合在PTPC中的ANT相互作用,改变线粒体膜通透性,导致凋亡诱导因子(AIF)和细胞色素C的释放,激活Caspase、DNases等的级联反应,引起核染色质的固缩,最终引起细胞凋亡。     

高糖通过线粒体途径诱导成骨细胞凋亡

线粒体途径是细胞凋亡的重要途径之一. 在特定的刺激下,例如高糖条件,可以通过caspase依赖性和非依赖性两种途径诱导多种细胞凋亡.但线粒体凋亡途径在高糖引起成骨细胞凋亡中所起的作用,目前尚不清楚.本研究证明,高糖可以通过线粒体凋亡途径诱导成骨细胞凋亡.Annexin V-FITC/PI流式细胞学检测显示,高糖可诱导MC3T3-E1细胞凋亡.Western印迹检测发现,不同浓度D-葡萄糖（11,22,33 mmol/L）可以引起线粒体中Bax蛋白表达的增加,使Bax蛋白由细胞质中易位到线粒体,激活了线粒体凋亡途径.JC-1荧光探针检测证实,高糖处理成骨细胞后,线粒体膜电位明显降低,表明线粒体途径被激活.而细胞质中的细胞色素c、凋亡诱导因子（AIF）表达增加,细胞色素c和AIF从线粒体中释放到细胞质中,释放到细胞质中的细胞色素c使caspase-3、caspase-9剪切活化,从而激活了caspase依赖性凋亡途径.因此,线粒体凋亡途径可能是高糖诱导成骨细胞凋亡过程中一个重要的途径.     

线粒体丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2与细胞凋亡

Omi／HtrA2是一种线粒体丝氨酸蛋白酶,具有修复、降解线粒体中折叠错误的蛋白质的作用,并可以通过破坏caspase与X染色体连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）之间的相互作用和直接利用其自身具有的蛋白酶活性引起细胞凋亡。本文介绍了Omi／HtrA2的结构、生物学作用、参与细胞凋亡的机制及其在某些疾病中的作用。     

华蟾素诱导人胃癌MKN-45细胞凋亡

本研究旨在探讨华蟾素诱导人胃癌MKN-45细胞凋亡及其机制.分别用终浓度0、60、70、80μg/L的华蟾素作用于人胃癌MKN-45细胞48 h,采用激光共聚焦显微镜观察细胞形态结构,流式细胞术检测细胞凋亡率、线粒体膜电位,RT-qPCR和Western blot分别检测Bax、Bcl-2、Cy tC、Caspase 9和Caspase 3基因表达水平.结果显示,与对照组相比,0、60、70、80μg/L的华蟾素作用人胃癌MKN-45细胞48h,呈现细胞皱缩、细胞核裂解、染色质凝集等形态学变化,早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞所占百分比均显著增加,线粒体膜电位(ΔΨm)显著降低.Bax、Cyt C、Caspase 9和Caspase 3基因的mRNA及蛋白表达水平随着药物浓度的升高均显著升高(P＜0.01),Bcl-2基因mRNA及蛋白表达水平随着药物浓度的升高显著降低(P＜0.01),提示华蟾素可通过上调Bax、Cyt C、Caspase 9和Caspase 3基因表达,下调Bcl-2基因表达诱导人胃癌MKN-45细胞凋亡.     

凋亡诱导因子的研究进展

凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)是一类存在于线粒体内外膜间隙的保守的黄素蛋白,具有双重功能。在细胞正常的生理状态下,作为线粒体氧化还原酶,能催化细胞色素c(Cytc)和NAD之间的电子传递,当细胞受到凋亡刺激后,就从膜间隙释放到细胞质中,并通过其核定位信号序列(nuclear localization sequence,NLS)进入细胞核内,引起染色体核周边凝集和DNA呈大片段断裂(约50kb),进而引发不依赖于caspase的细胞凋亡。AIF的释放受Bcl-2家族蛋白的调控,同时也受Hsp70的抑制,它还是多聚(ADP核糖)聚合酶1[poly(ADP-ribose)polymerase1,PARP1]介导的细胞凋亡途径的下游效应物。     

二烯丙基三硫通过线粒体依赖性途径诱导人肝癌HepG2细胞凋亡

二烯丙基三硫(diallyl trisulfide,DATS)对多种肿瘤有抗癌作用,但机制尚不完全清楚．为探讨DATS对人肝癌细胞系HepG2细胞凋亡的影响,用丫啶橙/溴化乙锭(AO/EB)法观察细胞凋亡情况,在显微镜下计数凋亡细胞数．JC-1荧光染色观察线粒体膜电势变化．Western blot法检测细胞色素c蛋白分布,ELISA法检测caspase-3活性． 结果显示,DATS诱导HepG2细胞凋亡,用 50 μmol/L 与100 μmol/L DATS处理48 h,细胞凋亡率分别达到60.33%和93.67%,并引起HepG2细胞线粒体膜电势降低．Western blot显示,DATS能诱导胞浆细胞色素c增加,与此同时,线粒体细胞色素c减少,诱导HepG2细胞caspase-3活化．提示：DATS可通过降低线粒体膜电势,促进细胞色素c由线粒体膜释放到胞浆中,激活caspase-3途径诱导人肝癌细胞系HepG2细胞凋亡．     

中药臭灵丹中3, 5-二羟基-6, 7, 3′, 4′-四甲氧基黄酮对人鼻咽癌CNE细胞凋亡的影响及机制

中药臭灵丹中黄酮类化合物3,5-二羟基-6,7,3′,4′-四甲氧基黄酮(3,5-hydroxy-6,7,3′,4′-tetramethoxyflavone,HTMF)体外对多种肿瘤细胞有抑增殖作用,但机制尚未完全清楚.为探讨HTMF对人鼻咽癌CNE细胞凋亡的影响,用MTT法检测HTMF对CNE细胞株的增殖抑制率,倒置显微镜观察HTMF作用于CNE细胞后细胞形态变化,Hoechst 33258荧光染色观察细胞核形态的变化,流式细胞仪检测细胞的凋亡率,Western blot法检测凋亡蛋白Caspase3和Caspase9的变化,流式细胞仪检测线粒体跨膜电位(△准m)值的改变,并用JC-1荧光染料染色,激光共聚焦显微镜观察线粒体膜电位变化.结果显示,分离自臭灵丹的HTMF呈浓度、时间双重依赖性显著抑制CNE细胞的增殖,诱导细胞凋亡,引起线粒体膜电位下降及凋亡蛋白Caspase3和Caspase9的活化.提示:3,5-二羟基-6,7,3′,4′-四甲氧基黄酮对人鼻咽癌CNE细胞的生长有显著的抑制作用,并可通过降低线粒体膜电位激活Caspase9,进而活化Caspase3诱导CNE细胞凋亡.