人B组轮状病毒vp7基因的克隆和序列分析

利用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)技术,扩增了人B组轮状病毒WH—2vp7基因,连接到克隆载体pUCm—T,并对其基因序列进行了分析。WH—2与ADRV的同源性达98％,与印度加尔各达分离株CAL—1达92％,而与动物B组轮状病毒同源性差别较大,如与IDIR(鼠)同源性仅为58％,与WD653(牛)B组轮状病毒同源性为63％,与ATI(牛)同源性为61％。对vp7基因的二级结构分析发现其mRNA折叠形成多达18个发卡环状结构。VP7蛋白是249个氨基酸组成,分子：量为28．4kDa,含有3个潜在的N连接的糖基化位点和多个磷酰化位点,从氨基酸序列的同源性来看,WH—2与ADRV的同源性达99％,与CAL—1达95％,而IDIR仅为51％,说明了WH—2和ADRV的起源相同。此研究对了解B组轮状病毒基因的进化和变异规律具有重要意义,也将为B组轮状病毒预防性疫苗的研制提供科学的依据。     

新成人腹泻轮状病毒J19株的全基因组克隆和VP4、VP6和VP7基因序列分析

为了进一步了解新成人腹泻轮状病毒J19株的基因和蛋白特征,利用一种改良的非依赖核酸序列的单引物扩增方法扩增J19株的11个基因,克隆到pMD18-T载体中并进行测序。在此基础上,将主要抗原蛋白VP4、VP6和VP7的蛋白序列与其它轮状病毒的相关蛋白序列进行比较分析并对VP6蛋白序列做遗传进化分析。结果获得J19株11个基因的全长基因序列。基因序列分析表明J19株的第3、6和第9基因分别长2 512bp、1 287bp和820bp,它们分别预测编码抗原蛋白VP4(823aa)、VP6(396aa)和VP7(258aa)。组成J19株的VP4、VP6和VP7蛋白序列对B组轮状病毒的CAL株、IDIR株以及ADRV株的相关蛋白序列的一致性分别是27.6%、38.5%和22.3%。对分组抗原蛋白VP6的遗传进化分析表明,J19株在进化树上的位置靠近外群蛋白分支以及A、B和C组轮状病毒分支的根部,而且它比较偏向于B组轮状病毒的分支。J19株的VP4、VP6和VP7蛋白序列与其它轮状病毒的相应蛋白序列存在显著差异。VP6蛋白序列的遗传进化分析表明J19株可能是一个新组轮状病毒的代表性毒株;同时,它也可能是一个与B组轮状病毒的起源和进化密切相关的毒株之一。关于新成人腹泻轮状病毒J19株11个基因的克隆及VP4、VP6和VP7基因的序列分析,这是第一次报道。     

兔出血症病毒NJ85株衣壳蛋白变异性分析及立体结构预测

用分子克隆技术从兔出血症病毒(RHDV)中国早期流行株NJ85中成功克隆出vp60基因,序列分析表明基因长度为1740nt,编码579aa.利用GenBank数据库,NJ85与WX84、TP二个RHDV中国毒株vp60基因DNA序列的同源性分别为92.7%和97.2%,氨基酸序列的同源性分别为96.1%和98.6%,与其他国家16个毒株的vp60基因DNA序列的同源性在83.7%～97.0%之间,氨基酸序列的同源性在90.5%～99.0%之间,具有高度的同源性. 进一步分析vp60基因的六个分区,A、B、D、F四个区变异率较低,C、E二个区变异率较高.在遗传进化上,历年来的RHDV毒株在氨基酸水平上分析可分为三个支谱系,在核苷酸水平上趋向四个支谱系,谱系没有呈现地域或时间特征.三个中国毒株分布在二个不同的支谱系中.与RHDV同为兔病毒属的欧洲野兔综合征病毒(EBHSV)组成了另一个谱系.运用生物信息学方法分析了NJ85 VP60蛋白的分子量、等电点、疏水性和二级结构,根据同源模型预测分析了三级结构.NJ85 VP60的二级结构以β片层为主,三级结构稳定.病毒衣壳表面有32个杯状凹陷, 由90个二聚体组成,二聚体由VP60单体以A/B5和C/C2两种方式构成,单体在二聚体中的构象有A、B、C三种形式.单体含有S、P两个结构域,两者通过柔性绞链连接,P结构域由VP60的C端部分形成,P分为P1和P2二个亚结构域,P2位于病毒衣壳表面,含有病毒株特异性抗原表位和红细胞结合位点.     

猪轮状病毒JL94株vp4全基因克隆及原核表达载体构建

根据GenBank已发表的猪轮状病毒vp4基因保守序列,设计一对引物扩增猪轮状病毒地方株JL94株vp4全基因;将扩增产物与载体pMD-18T连接进行序列测定并将测序结果同国外分离株进行序列比较。用限制性内切酶BamHI和SalI将vp4基因从pMD-18T-vp4切下;同样用BamHI和SalI双酶切表达载体pGEX-6P-1;将这2个双酶切产物连接并转化,通过酶切鉴定和PCR鉴定证明完成了vp4原核表达载体的构建。测序结果表明:vp4全基因长2362bp,JL94株同国外分离株BEN307株、Gottfried株vp4全基因片段核苷酸同源性分别为93.44%和69.43%;氨基酸同源性分别为96.06%和71.88%。说明JL94株同BEN-307株属同一VP4血清型,而同Gottfried株属于不同血清型。重组原核表达载体pGEX-6P1-vp4的构建为表达VP4蛋白,研制诊断性抗原和病毒重组活载体疫苗奠定了基础。     

兔出血症病毒NJ85株衣壳蛋白变异性分析及立体结构预测

用分子克隆技术从兔出血症病毒(RHDV)中国早期流行株NJ85中成功克隆出vp60基因,序列分析表明基因长度为1740nt,编码579aa。利用GenBank数据库,NJ85与WX84、TP二个RHDV中国毒株vp60基因DNA序列的同源性分别为92．7％和97．2％,氨基酸序列的同源性分别为96．1％和98．6％,与其他国家16个毒株的vp60基因DNA序列的同源性在83．7％-97．0％之间,氨基酸序列的同源性在90．5％～99．0％之间,具有高度的同源性。进一步分析vp60基因的六个分区,A、B、D、F四个区变异率较低,C、E二个区变异率较高。在遗传进化上,历年来的RHDV毒株在氨基酸水平上分析可分为三个支谱系,在核苷酸水平上趋向四个支谱系,谱系没有呈现地域或时间特征。三个中国毒株分布在二个不同的支谱系中。与RHDV同为兔病毒属的欧洲野兔综合征病毒(EBHSV)组成了另一个谱系。运用生物信息学方法分析了NJ85 VP60蛋白的分子量、等电点、疏水性和二级结构,根据同源模型预测分析了三级结构。NJ85 VP60的二级结构以B片层为主,三级结构稳定。病毒衣壳表面有32个杯状凹陷,由90个二聚体组成,二聚体由VP60单体以A／B5和C／C2两种方式构成,单体在二聚体中的构象有A、B、C三种形式。单体含有S、P两个结构域,两者通过柔性绞链连接,P结构域由VP60的C端部分形成,P分为P1和P2二个亚结构域,P2位于病毒衣壳表面,含有病毒株特异性抗原表位和红细胞结合位点。     

家蚕核型多角体病毒中国株和日本株vp39基因的比较研究

以苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的核衣壳蛋白基因vp39设计引物,用PCR技术扩增了家蚕核型多角体病毒中国株(BmNPV-Ch)～1.3kb片段,并测定了其全序列长1230bp。推导的氨基酸351个,其与BmNPV日本株(BmNPV-Ja)vp39基因核苷酸序列同源性达97.5%,氨基酸同源性达97.1%。该片段在E.coli BL21中诱导表达能产生分子量约为38kD 的特征性蛋白带,证明所扩增片段为BmNPV-Ch的vp39基因。经与BmNPV-Ja比较,其625位 有3个核苷酸(CGA),985～910位有6个核苷酸(GTCGGC)的插入,未造成码组移动。有17处点突变,但取代突变(replacement mutation)仅7处,对两株病毒VP39蛋白的亲疏水性和酸碱 性质未产生显著影响。由于点突变带来氨基酸改变,使BmNPV-Ch的vp39蛋白的α-螺旋由13.2%增加到15.4%,无规卷曲由7.2%减少到5.8%,β-折叠和β-转角维持不变,约为79.6%,仍保持以β-折叠为主要二级结构单元的片层状折叠结构。     

猪轮状病毒JL94中国分离株衣壳蛋白基因的分析

根据GenBank发表的猪轮状病毒衣壳蛋白vp4基因、vp6基因和vp7基因保守序列,设计合成3对引物,分别扩增猪轮状病毒中国分离株JL94株的此3段基因并进行序列分析。结果表明,JL94株vp4基因与国外分离株CRW-8株、OSU株、Gottfried株、4F株和4S株的VP4氨基酸同源性分别为97.16％、95％、71.88％、73.45％和70.88％;JL94株vp6与CRW-8株、OSU株、Gottfried株、4F株和4S株的VP6氨基酸同源性分别为96.98％、97.48％、93.20％、97.48％和93％;JL94株vp7基因与CRW-8株、OSU株、Gottfried株、4F株和4S株的VP7氨基酸同源性分别为98％、99.90％、75.40％、84.66％和80％。可见JL94株同CRW-8株、OSU株同源性更高些;vp4和vp7基因在同型间高度保守而不同型间差距较大,vp6基因在同群和非同群间差别不是很明显。同时可以判定JL94属于A群Ⅰ亚群G5P7血清型PRV。研究猪轮状病毒中国分离株JL94株衣壳蛋白基因的特征,为研制高效抗病毒疫苗奠定基础。     

Asia1型口蹄疫病毒分离株结构蛋白基因的克隆与表达

口蹄疫病毒结构蛋白氨基酸的变化是病毒抗原性变异的分子基础,大部分抗原表位位于主要的免疫原蛋白VP1上,部分非线性抗原表位位于VP2和VP3上。本研究首次成功测定了 Asia1 型口蹄疫病毒(YNBS/58)四种结构蛋白基因( p1 区)的核苷酸序列,全长 2199 个碱基,编码 733 个氨基酸,该基因与 Ind63/72、Pka3/54、Israel、China/99、C1/Germany、A22、ZIM7/83/2 毒株的 p1 基因核苷酸序列同源性分别为 88. 4%、86. 0%、89. 3%、68.6%、67.6%、66.8%、50.3%,推导的氨基酸序列同源性分别为 94.1%、93.2%、95.1%、79.9%、77.0%、76.5%、58.1%;将YNBS/58株与 Ind63/72、Pka3/54、Israel株的 vp1、vp2、vp3、vp4 基因和编码蛋白分别进行同源性比较,发现VP1的序列变异最大,VP2、VP3、VP4次之,且VP1的氨基酸变异主要集中在 42-50 位和 137-156 位。实现了YNBS/58株结构蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达,其表达的融合蛋白以包涵体形式存在,分子量约为88kDa,占菌体总蛋白的16%左右,并利用镍柱对目的蛋白进行了纯化,纯度达 90%以上,本实验为进一步研究 A sia1型口蹄疫病毒的分子流行病学、p1基因及其编码蛋白的生物学功能奠定了基础。     

猪轮状病毒vp4基因在大肠杆菌中的表达

以猪轮状病毒JL94株核酸为模板扩增该病毒vp4全基因,对扩增产物进行测序及序列比较;根据VP4的5'端(1bp～750bp)特异片段主要决定其活性的观点,再设计一对引物扩增该主要抗原位点基因,将此主要抗原位点基因同pGEX-6P-1载体连接并转化入E.coli.BL21(DE3)plays,经IPTG诱导表达出蛋白质;对表达的蛋白进行Westernblot分析、纯化和血清中和抗体试验.结果表明JL94株与国外分离株CRW-8株、BEN-307株vp4全基因片段氨基酸同源性分别为96.98%和98.05%,说明JL94株与CRW-8株、BEN-307株属于同一VP4血清型;经IPTG诱导VP4主要抗原位点基因获得了高效表达,表达量占菌体蛋白的26%;Westernblot结果和所表达的融合蛋白免疫小鼠产生的中和抗体能阻断JL94在MA104细胞上引起的细胞病变,说明所表达蛋白有良好的生物学活性.     

Asia1型口蹄疫病毒分离株结构蛋白基因的克隆与表达

口蹄疫病毒结构蛋白氨基酸的变化是病毒抗原性变异的分子基础,大部分抗原表位位于主要的免疫原蛋白VP1上,部分非线性抗原表位位于VP2和VP3上.本研究首次成功测定了Asia1型口蹄疫病毒(YNBS/58)四种结构蛋白基因(p1区)的核苷酸序列,全长2199个碱基,编码733个氨基酸,该基因与Ind63/72、Pka3/54、Israel、China/99、C1/Germany、A22、ZIM7/83/2毒株的p1基因核苷酸序列同源性分别为88.4%、86.0%、89.3%、68.6%、67.6%、66.8%、50.3%,推导的氨基酸序列同源性分别为94.1%、93.2%、95.1%、79.9%、77.0%、76.5%、58.1%;将YNBS/58株与Ind63/72、Pka3/54、Israel株的vp1、vp2、vp3、vp4基因和编码蛋白分别进行同源性比较,发现VP1的序列变异最大,VP2、VP3、VP4次之,且VP1的氨基酸变异主要集中在42-50位和137-156位.实现了YNBS/58株结构蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达,其表达的融合蛋白以包涵体形式存在,分子量约为88kDa,占菌体总蛋白的16%左右,并利用镍柱对目的蛋白进行了纯化,纯度达90%以上,本实验为进一步研究A-sia1型口蹄疫病毒的分子流行病学、p1基因及其编码蛋白的生物学功能奠定了基础.