Bax蛋白在大鼠肝癌发生过程中的表达和意义

通过动态观察Bax蛋白在实验性大鼠肝癌发生过程中肝细胞的表达,探讨Bax蛋白与肝癌发生的关系及其生物学意义。用DEN饲喂大鼠,分别于第4、8、12、16、18周处死大鼠,取其肝脏,石蜡切片,ABC法免疫组织化染色。结果显示：正常成年大鼠肝细胞均有中等程度Bax蛋白表达。至诱癌第4周大鼠肝小叶内有少数肝细胞呈Bax蛋白免疫阳性反应,随诱癌发展进程,呈Bax蛋白免疫阳性反应肝细胞进一步减少,第12周,只可见肝细胞增生结节的多数肝细胞呈Bax蛋白免疫阳性反应。诱癌晚期（第18周）,癌结节内肝癌细胞均呈Bax免疫反应阳性,其强度较正常肝细胞明显增强,Bax蛋白免疫反应产物为胞质内粗大的棕褐色颗粒。部争肝细胞胞质和胞膜均呈阳性,肝癌细胞最为常见。结果表明：Bax蛋白表达减少或缺失是肝癌发生过程中的早期事件,可能参与肝癌的启动过程。     

化学诱发大鼠肝癌的亚细胞组分中两类丝氨酸蛋白激酶的动态变化

用二乙基亚硝胺大鼠肝癌,隔周测定肝脏胞液、膜性和胞核中的蛋白激酸Ａ和蛋白激酶的活力,发现胞液ＰＫＡ在诱癌过程中活力改变不大,胞淮ＰＫＣ则逐步增高,在第１３周和２０周形成两个活力高峰。膜性ＰＫＡ和ＰＫＣ都呈双相变化,即在癌前期（１０－１４周）增加,癌形成期（１７－２０周）反而降至正常以下,胞核ＰＫＡ和ＰＫＣ也都在癌前期升至高峰,而癌形成期则低于癌前期,但仍高于正常或接近正常,因只有膜性ＰＫＣ在大鼠老     

二乙基亚硝胺诱发肝癌的大鼠中维生素K依赖性羧化酶的研究

本文证明DENA诱发的大鼠肝癌结节中维生素K依赖性羧化酶活性显著降低,外源多肽羧化酶活性只有正常大鼠肝脏中的62.6％,而内源蛋白质前体羧化酶活性仅为27％。华法令能在正常大鼠肝脏中诱导羧化酶的合成,而这种诱导能力在诱癌晚期的肝癌大鼠肝脏中明显下降。上述结果说明肝癌细胞中维生素K依赖性羧化酶的合成受阻,造成肝癌组织中羧化酶的缺乏。诱癌过程中大鼠肝脏维生素K依赖性羧化酶活性和血浆异常凝血酶原水平形成良好的对应关系。随着肝癌组织的增大,肝癌细胞分泌入血的异常凝血酶原水平显著升高,诱癌第20周时的大鼠血浆中异常凝血酶原含量为正常大鼠的2.5倍。由此认为,肝癌组织由于不能合成足量的维生素K依赖性羧化酶,导致凝血酶原在成熟过程中羧化受阻,分泌入血形成高水平的异常凝血酶原。     

大鼠肝癌发生过程中NF-κB的表达

目的探讨核转录因子-κB(NF-κB)在大鼠肝癌发生发展中的作用和意义。方法应用免疫组织化学SP法,对二乙基亚硝胺(DEN)诱发的大鼠肝癌发生过程中NF-κB的动态表达进行了检测。结果 DEN诱发的肝癌为肝细胞癌,诱癌率为100%,大鼠肝癌癌变过程大致经过肝细胞损伤期、肝细胞增生-硬化期和肝细胞癌变期等三个阶段。在正常大鼠肝组织,偶见少量肝细胞呈阳性表达,随着肝癌发生发展,NF-κB阳性表达细胞逐渐增多,至诱癌晚期,可见大量NF-κB阳性表达细胞,均比正常肝组织表达高(P<0.05)。结论本研究表明肝细胞NF-κB的过度表达与肝癌的发生和发展密切有关。     

大鼠肝癌发生过程中转化生长因子-β1的表达及意义

为了进一步探讨转化生长因子-β1在肝癌发生中的作用和意义。本采用免疫组织化学ABC法,对二乙基亚硝胺（DEN）诱发大鼠肝癌发生过程中转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）表达情况进行了观察。结果显示;在正常大鼠肝脏,TGF-β1的表达只局限于血窦内皮细胞或枯否细胞,汇管区血管内皮细胞及胆管上皮细胞,肝细胞呈TGF-β1阴性表达,诱癌早期（4-8周）,大鼠肝小叶内除血窦内皮细胞或枯否细胞呈TGF-β1阳性表达外,可见少量散在分布的肝细胞呈TGF-β1阳性表达,阳性肝细胞胞质内可见棕褐色阳性反应颗粒,随着肝癌发展,TGF-β1阳性肝细胞逐渐增多,至诱癌晚期（18周）,癌结节内的大多数肝癌细胞呈TGF-β1阳性表达。本研究显示TGF-β1与肝癌的发生和发展密切相关。至诱癌晚期（18周）,癌结节内的大多数肝癌细胞呈TGF-β1阳性表达,本研究显示TGF-β1与肝癌的发生和发展密切相关。     

化学诱发大鼠肝癌的亚细胞组分中两类丝氨酸蛋白激酶的动态变化

用二乙基亚硝胺（ＤＥＮ）诱发大鼠肝癌,隔周测定肝脏胞液、膜性和胞核中的蛋白激酶Ａ（ＰＫＡ）和蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）的活力。发现胞液ＰＫＡ在诱癌过程中活力改变不大,胞液ＰＫＣ则逐步增高,在第１３周和２０周形成两个活力高峰。膜性ＰＫＡ和ＰＫＣ都呈双相变化,即在癌前期（１０－１４周）增加,癌形成期（１７－２０周）反而降至正常以下,胞核ＰＫＡ和ＰＫＣ也都在癌前期升至高峰,而癌形成期则低于癌前期,但仍高于正常（ＰＫＡ）或接近正常（ＰＫＣ）。因只有膜性ＰＫＣ在大鼠老化时降低,故这些变化不是鼠龄变化的结果,而是ＤＥＮ诱癌所引起,其变化机理可能与下降调节、细胞内转位或两型同工酶相反的升降变化有关。     

苦参素联合富硒酵母干预大鼠肝癌变进程中TERT表达的变化

目的：探讨大鼠肝脏端粒酶逆转录酶（TERT）在肝癌演进及药物干预中表达的变化。方法：在建立大鼠肝癌变模型的基础上,用苦参素联合富硒酵母（OMT＋Se）对其进行干预。分别在诱癌2．4、6、8、10、12、14、16和18周处死大鼠。病理分级后用免疫组化和Westernblot法,分别显示大鼠肝端粒酶逆转录酶（TERT）表达的变化。结果：诱癌组’IERT表达在诱癌各时期均显著高于对照组（P〈0．05,P〈O．01）。干预组TERT在腺瘤样增生期（AH）和非典型性腺瘤样增生期（AAH）的表达均显著低于诱癌组（P〈0．05）。结论：OMT＋Se的联合干预抑制了癌变进程中TERT的表达,可在一定程度上延缓和推迟肝癌的发生发展。     

大鼠肝癌发生过程中p53的突变和甲胎蛋白的表达

采用免疫组织化学ＡＢＣ和ＰＡＰ法,对二乙基亚硝胺（ＤＥＮ）诱发大鼠肝癌发生过程中突变型ｐ５３蛋白（ｍｐ５３）和甲胎蛋白（ＡＦＰ）在肝细胞中的表达进行了系统观察。结果显示：（１）ＤＥＮ诱发大鼠肝癌发生率为１００％;（２）正常大鼠及诱癌第４周大鼠的肝细胞均不表达ｍｐ５３,至诱癌第８周,可见少量肝细胞表达ｍｐ５３,诱癌晚期的癌结节内大部分肝癌细胞呈ｍｐ５３阳性表达,ｍｐ５３免疫反应阳性产物为胞核内棕褐色颗粒;（３）正常大鼠肝细胞不表达ＡＦＰ,诱癌早期（４～８周）的大鼠肝小叶内可见少量ＡＦＰ阳性肝细胞,多为小肝细胞,呈散在分布,此后ＡＦＰ阳性肝细胞逐渐增多,晚期的癌结节内大部分癌细胞呈ＡＦＰ阳性,ＡＦＰ免疫反应阳性产物为胞浆内棕褐色颗粒。结果提示,ｍｐ５３和ＡＦＰ可作为分析肝癌进展的病理学指标     

615系小鼠可移植性肝癌组织中不依赖于cAMP的蛋白激酶研究

作者对H₆₁₅(原发性)和H₂₂(OAAT诱发)肝癌组织中不依赖于cAMP的蛋白激酶进行了研究,发现当以内源性蛋白为底物时,H₆₁₅和H₂₂组织中的酶活力分别是正常肝脏的3.10和2.44倍。以脱磷卵黄高磷蛋白和鱼精蛋白为底物时,肿瘤组织的酶活力是正常肝脏的1.5—4.45倍。研究结果表明,不依赖于cAMP的蛋白激酶活力升高与癌变和癌恶性状态的维持有密切联系。     

实验性肝癌糖原和癌基因N-ras表达的研究

通过应用原位杂交和组织化学技术,对二乙基亚硝胺诱发的大鼠肝细胞肝癌中糖原和癌基因Ｎ－ｒａｓ表达的研究,发现从诱癌早期到晚期,肝细胞内的糖原由储积而逐渐丧失。Ｎ－ｒａｓ在诱癌的第１～２周即出现阳性表达,随诱癌过程的延长,阳性表达的细胞数和范围逐渐增加,至诱癌晚期甚至在癌结节内均转为阴性。对肝组织连续切片中糖原和Ｎ－ｒａｓ表达的对比观察发现,糖原ＰＡＳ反应与Ｎ－ｒａｓ反应同步,糖原ＰＡＳ反应具有与Ｎ－ｒａｓ一致的异质性,其阳性与阴性病变分布与Ｎ－ｒａｓ表达重叠。提示Ｎ－ｒａｓ基因表达可能在肝癌的启动过程中发挥重要作用,并且可能涉及对糖原基因的调控。     

大鼠诱发型肝癌发生发展过程中SonicHedgehog、Ptc和Gli1表达的改变

目的 观察大鼠诱发肝癌过程中Sonic Hedgehog（Shh）信号通路相关基因的表达变化,探讨其在肝癌发生发展过程中的作用.方法 雄性Wistar大鼠48只,随机分成4组,利用二乙基亚硝胺（DEN）制备诱发性大鼠肝癌模型,应用原位核酸杂交技术检测Shh、Ptc、Gli1 mRNA在对照组、模型组（6w）、模型组（14w）、模型组（22w）大鼠肝脏癌变过程中的表达变化.结果 在模型组（6w）大鼠肝脏的肝小叶周边可见嗜酸性、气球样变性等肝细胞损伤的表现,模型组（14w）大鼠肝脏中可见肝假小叶和非典型增生结节,模型组（22w）大鼠肝脏中可见到高分化的肝细胞癌结节.Shh、Ptc、Gli1 mRNA阳性表达细胞主要分布在大鼠肝脏中的肝细胞损伤区、增生结节、癌结节、小叶间胆管上皮和癌旁组织中,Shh、Ptc、Gli1 mRNA在模型组的大鼠肝组织中表达的平均光密度值均高于对照组.结论 Shh信号通路在诱癌过程中异常激活,可能促进肝损伤后的正常修复、异常增殖及肝细胞癌变过程.     

性激素对大鼠诱发肝癌中胎盘型谷胱甘肽S-转移酶(GST-P)表达的影响

本实验利用Solt-Farber顺序诱发大鼠肝癌,观察肝组织中GST活性及GST-P含量在化学诱癌中的变化,并观察性激素对大鼠化学诱发肝癌的早期病变中GST-P表达的作用。结果显示无论是GST活性或GST-P的含量,在诱癌至第三周开始升高,第五周升至最高。利用此模式,选择诱癌至第五周,免疫组化法检测各种处理后肝组织中GST-P的表达。发现睾丸假切除的雄性大鼠经化学诱癌后,肝中有高的GST-P表达,睾丸假切除的雄性大鼠诱癌合并雌二醇处理,明显降低肝组织GST-P阳性灶的面积和数量;合并睾丸酮处理,虽减少GST-P阳性灶的面积,但其数量略有升高。与睾丸假切除后诱癌的雄性大鼠相比,切除睾丸的大鼠经诱癌,有更低的GST-P阳性灶的面积;睾丸切除合并雌二醇处理,GST-P阳性灶的面积进一步降低。与仅化学诱癌的卵巢假切除雌性大鼠比,卵巢切除鼠诱癌后,GST-P阳性灶的面积稍有增加;对卵巢切除合用睾丸酮的大鼠诱癌,阳性灶的面积进一部增加。无论性腺切除与否,雄性大鼠比雌性大鼠有更高的GST-P表达。这些结果提示雌激素可抑制而雄激素则可促进化学诱癌大鼠肝中GST-P的表达。这一结果可能与临床上男性较女性易患肝癌有关。     

大鼠正常肝、肝癌前病变组织谷胱甘肽S-转移酶的纯化及部分性质的研究

本文用S-己基谷胱甘肽-琼脂糖-6B亲和层析一步纯化法分别获得电泳纯大鼠正常肝GST_S及含增生结节大鼠肝GST_S。经DE_(52)阴离子交換柱将含增生结节大鼠肝GST_S分离为三个同功酶组份,依次命名为C_(DE)A1及A2,C_(DE)占上柱总GST_S活性84.8％。等电聚焦电泳测定等电点分别为7.8、6.7及6.3。经CM_(52)阳离子交換柱获得五个同功酶组份,依次命名为A_(CM),C1,C2,C3及C4,等电点分别为7.8,7.4,7.9,8.3及8.6。A_(CM)的活性占CM_(52)柱上柱总活性的10％。SDS-PAGE电泳结果和正常大鼠肝GST_S比较,含增生结节大鼠肝GST_S同样出现Ya,Yb及Yc三条区带,而后者的氨基酸组成也与正常大鼠肝GST_S相近,但是和大鼠正常肝组织比较后者GST_S活性明显升高,以阳离子同工酶的活性为主。     

雄激素受体在肝癌发生过程中的表达及意义

为了进一步探讨雄激素受体（ＡｎｄｒｏｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒ,ＡＲ）作为肝癌标志物的意义,本文采用免疫组织化学ＡＢＣ法,对二乙基亚硝胺（ＤＥＮ）诱发大鼠肝癌发生过程中肝细胞雄激素受体（ＡＲ）的表达进行了系统观察。结果显示：正常大鼠的ＡＲ阳性肝细胞极少,ＤＥＮ诱癌第４周可见少量肝细胞呈ＡＲ阳性表达,细胞散在分布,胞质和／或胞核内可见棕褐色阳性反应颗粒。随着肝癌发展进程,ＡＲ阳性肝细胞数逐渐增多,呈簇状或片状分布。至诱癌第１８周,肝癌结节内肝癌细胞大多呈ＡＲ阳性表达。本实验结果表明,ＡＲ与肝癌的发生和发展具有密切关系     

肝癌大鼠异常凝血酶原的研究

用灵敏的凝血酶原蛇毒激活测定法,观察二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌过程中,血浆异常凝血酶原及肝组织内凝血酶原前体含量的变化。血浆异常凝血酶原从诱癌第4周开始持续上升至第13周;第15周有所下降,第20周又开始回升。而在此过程中,肝组织内凝血酶原前体含量变化不明显,而在诱癌20周的肝癌结节内,凝血酶原前体显著堆积。同时,还研究了肝再生过程中大鼠血桨异常凝血酶原及肝内凝血酶原前体的变化。华法令处理的大鼠作为阳性对照。     

大鼠肝癌发生过程中增殖细胞核抗原（PCNA／Cyclin）的表达

应用免疫组织化学的ＡＢＣ法,对二乙基亚硝胺（ＤＥＮ）诱发大鼠发生过程中增殖细胞核抗原在肝组织中的表达进行了系统观察。结果显示：正常大鼠肝组织中仅见极少数ＰＣＮＡ阳性肝细胞,阳性率为０．０８％,随着诱癌进程发展,大鼠肝组织中ＰＣＮＡ阳性肝细胞逐渐增多,诱癌第４、８、１２周,大鼠肝组织中ＰＣＮＡ阳性肝细胞百分率分别为１．６％、３．８％、１６．２％,诱癌晚期癌结节内大部分肝癌细胞里ＰＣＮＡ阳性表达,阳性率为８０．６％。本研究结果表明原位检测ＰＣＮＡ表达比传统依据形态学分化程度来判断肿瘤发生可能性更为客观、可靠。     

大鼠诱发肝癌过程中N乙酰氨基葡萄糖转移酶V的高效液相层析测定

提纯人血浆运铁蛋白(Tf),经链霉蛋白酶水解,再经肼解法制备Tf中的二天线N糖链,后者经还原末端的氨基吡啶(PA)化进行荧光标记,再切除外链的唾液酸和半乳糖残基,获得Gn_2Man_3Gn_2-PA荧光标记糖链,以此制备的糖链为受体底物,UDP-GlcNAc为供体底物,用反相HPLC分离底物和产物,建立了N乙耽氨基葡萄糖转移酶V(GnT-V)的测定法。用GnT-V作为肿瘤生化标志物,观察到在二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌的过程中,此酶在诱癌第4周轻度上升,第6周恢复,第10周后持续升高,至18周达正常鼠肝的20倍以上,与病理学上的癌变期相一致。     

二乙基亚硝胺诱导大鼠肝癌组织CLDN1基因表达及其甲基化

目的探讨二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine,DEN）诱导大鼠肝癌发生中肝癌组织CLDN1基因表达及其启动子甲基化的规律。方法65只雄性Wistar大鼠随机选择40只作为模型组,其余作为正常组。模型组在1-12周饮用含DEN80mg／L的饮水以诱癌（每日8mg／kg）,各组在造模过程的第4周、8周、12周、16周随机5只取肝,第20周剩余大鼠取肝,应用RT-PCR方法检测肝组织CLDN1mRNA的表达,应用MSP法检测肝组织CLDN1启动子甲基化和非甲基化。结果模型大鼠病死率为10％（4／40）,正常组无死亡。至第20周,成瘤率达到100％。RT—PCR显示,与正常组比较,模型组在16周和20周CLDN1 mRNA表达下调（P〈0．05）,其他各周两组差异不显著。MSP结果表明,模型组肝组织CLDN1甲基化率达77．78％,而正常肝组织甲基化率为24％,两者比较差异有显著性（P〈0．01）。结论CLDN1启动子甲基化及CLDN1基因表达下调与大鼠肝癌病变相关,对其机制值得进一步深入研究。     

大鼠肝癌模型中Piwil4、Mael和Ddx4基因mRNA和蛋白表达水平及其与肿瘤检测的关系

PIWI和piRNA的表达水平与肿瘤类型密切相关。Piwil2 mRNA在肝癌中的表达量比肿瘤周围的肝脏组织的表达量高。PIWI/piRNA通路基因Piwil4、Mael和Ddx4为候选癌基因,在多种癌组织中表达,而在肝癌组织中的研究尚无报道。为探讨Piwil4、Mael和Ddx4基因在肝癌组织中表达水平变化的影响,建立了大鼠肝癌模型,并提取血清用ELISA方法检测肿瘤标记物,采用实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹方法和免疫组织化学方法检测正常肝组织与模型组肝组织中Piwil4、Mael和Ddx4基因mRNA转录和蛋白表达水平。结果表明,大鼠肝癌动物模型血清中肿瘤标记物含量明显升高。Piwil4、Mael和Ddx4基因mRNA及蛋白在肝癌模型组织中高表达。研究表明,肝癌模型组织中Piwil4、Mael和Ddx4基因表达水平有望作为肝癌检测的一种分子标志物。     

大鼠肝癌诱发过程中血粘度及红细胞变形能力的异常改变

为了全面地反映肝癌发生发展整个过程的血液流变性的异常,本实验采用二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌模型,分六个相检测五个切变率下的全血粘度、血浆粘度及红细胞变形能力。结果表明红细胞变形能力随着肿瘤发展逐渐减低,血浆粘度随着诱癌时间延长 渐升高,到肿瘤晚期趋于平缓,而全血粘度先是升高,到诱癌２０周以后反而有下降趋势。