Sonic hedgehog在二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌发生过程中的表达及意义

观察肝脏组织中Sonic hedgehog(Shh)的表达情况,探讨其在肝癌发生发展过程中的作用.用二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)制备诱发型肝癌模型,利用光镜技术观察诱癌过程中肝组织的形态学改变,采用免疫组织化学二步法和RT-PCR技术检测Shh蛋白和mRNA的表达.根据形态学观察将诱癌过程分为正常对照组、肝损伤组、肝增生-硬化组和肝癌变组.Shh蛋白阳性表达的细胞主要分布在小叶间胆管上皮、肝细胞增生结节、癌周组织和癌结节中,在对照组、肝损伤期、肝增生-硬化期和肝癌变期的阳性表达率分别是6.67%、30.00%、52.94%和78.57%(χ2=17.49,P<0.05).Shh mRNA表达率随着肝癌的发生发展有逐渐增高的趋势(χ2=13.35,P<0.05),对Shh mRNA表达阳性的电泳条带进行图像分析结果显示Shh mRNA表达量随着肝癌的发生发展逐渐增高(F=110.26,P<0.05).Ptch mRNA表达率随着肝癌的发生发展有逐渐增高的趋势(χ2=19.83,P<0.05),对Ptch mRNA表达阳性的电泳条带进行图像分析结果显示Ptch mRNA表达量随着肝癌的发生发展逐渐增高(F=68.28,P<0.05).实验结果提示,Shh在肝癌发生发展过程中出现了异常活动,导致Shh信号通路激活并作用于肝的细胞,参与了诱导肝癌的发生发展.     

大鼠肝癌发生过程中p53的突变和甲胎蛋白的表达

采用免疫组织化学ＡＢＣ和ＰＡＰ法,对二乙基亚硝胺（ＤＥＮ）诱发大鼠肝癌发生过程中突变型ｐ５３蛋白（ｍｐ５３）和甲胎蛋白（ＡＦＰ）在肝细胞中的表达进行了系统观察。结果显示：（１）ＤＥＮ诱发大鼠肝癌发生率为１００％;（２）正常大鼠及诱癌第４周大鼠的肝细胞均不表达ｍｐ５３,至诱癌第８周,可见少量肝细胞表达ｍｐ５３,诱癌晚期的癌结节内大部分肝癌细胞呈ｍｐ５３阳性表达,ｍｐ５３免疫反应阳性产物为胞核内棕褐色颗粒;（３）正常大鼠肝细胞不表达ＡＦＰ,诱癌早期（４～８周）的大鼠肝小叶内可见少量ＡＦＰ阳性肝细胞,多为小肝细胞,呈散在分布,此后ＡＦＰ阳性肝细胞逐渐增多,晚期的癌结节内大部分癌细胞呈ＡＦＰ阳性,ＡＦＰ免疫反应阳性产物为胞浆内棕褐色颗粒。结果提示,ｍｐ５３和ＡＦＰ可作为分析肝癌进展的病理学指标     

藻毒素MC-LR促二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌模型建立的方法

摘要肝癌动物模型有助于肝癌发病过程中分子机制的研究。二乙基亚硝胺（DEN）是一种众所周之的化学致癌剂,已被广泛用于动物肝癌模型的建立。藻毒素MC-LR是一种由蓝藻产生的环状七肽毒素,其低浓度的慢性毒性具有潜在的促癌作用。该实验以DEN联合不同浓度的藻毒素MC．LR通过腹腔注射共同诱发大鼠肝癌模型。从形态学、病理学角度分别观察大鼠肝脏外观和肝细胞的变化;从蛋白质水平运用免疫印迹法检测谷胱甘肽-S-转移酶（GST-Pi）的表达情况。结果表明,模型组中大鼠肝癌癌变过程大致经过肝细胞损伤期、肝细胞增生-硬化期和肝细胞癌变期三个阶段。其中,DEN联合终浓度为10pg／kg的藻毒素MC－LR处理时促癌效果最佳。该方法可作为一种新型的大鼠肝癌模型建立方法为今后的研究奠定基础。     

大鼠肝癌发生过程中NF-κB的表达

目的探讨核转录因子-κB(NF-κB)在大鼠肝癌发生发展中的作用和意义。方法应用免疫组织化学SP法,对二乙基亚硝胺(DEN)诱发的大鼠肝癌发生过程中NF-κB的动态表达进行了检测。结果 DEN诱发的肝癌为肝细胞癌,诱癌率为100%,大鼠肝癌癌变过程大致经过肝细胞损伤期、肝细胞增生-硬化期和肝细胞癌变期等三个阶段。在正常大鼠肝组织,偶见少量肝细胞呈阳性表达,随着肝癌发生发展,NF-κB阳性表达细胞逐渐增多,至诱癌晚期,可见大量NF-κB阳性表达细胞,均比正常肝组织表达高(P<0.05)。结论本研究表明肝细胞NF-κB的过度表达与肝癌的发生和发展密切有关。     

大鼠肝癌发生过程中转化生长因子-β1的表达及意义

为了进一步探讨转化生长因子-β1在肝癌发生中的作用和意义。本采用免疫组织化学ABC法,对二乙基亚硝胺（DEN）诱发大鼠肝癌发生过程中转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）表达情况进行了观察。结果显示;在正常大鼠肝脏,TGF-β1的表达只局限于血窦内皮细胞或枯否细胞,汇管区血管内皮细胞及胆管上皮细胞,肝细胞呈TGF-β1阴性表达,诱癌早期（4-8周）,大鼠肝小叶内除血窦内皮细胞或枯否细胞呈TGF-β1阳性表达外,可见少量散在分布的肝细胞呈TGF-β1阳性表达,阳性肝细胞胞质内可见棕褐色阳性反应颗粒,随着肝癌发展,TGF-β1阳性肝细胞逐渐增多,至诱癌晚期（18周）,癌结节内的大多数肝癌细胞呈TGF-β1阳性表达。本研究显示TGF-β1与肝癌的发生和发展密切相关。至诱癌晚期（18周）,癌结节内的大多数肝癌细胞呈TGF-β1阳性表达,本研究显示TGF-β1与肝癌的发生和发展密切相关。     

局灶缺血性脑卒中大鼠侧脑室下带Shh信号通路成分的动态表达

通过研究Sonic hedgehog(Shh)信号通路成分在局灶缺血性脑卒中大鼠侧脑室下带(subventricular zone,SVZ)的动态表达,初步探讨该通路在局灶性缺血性脑卒中后神经再生的调控作用.将84只健康成年雄性SD大鼠随机分为正常组(n=12)、假手术组(n=12)、缺血6、12、24 h和3、7 d,共7组(n=12).采用线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉阻断(middle cerebral artery occlussion,MCAO)模型.分别应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化、免疫印迹法检测局灶脑缺血大鼠侧脑室下带Shh、Gli1 mRNA和蛋白变化.与正常组比较,Shh、Gli1mRNA和蛋白在假手术组表达变化不明显(P>0.05),模型组6 h表达增高(P<0.01),24 h达峰值(P<0.01),3 d时接近正常水平(P>0.05),7 d表达又升高(P<0.01).缺血性脑卒中可以上调Shh信号通路成分在SVZ区的表达,提示Shh信号通路可能参与卒中后神经再生机制的调控.     

雄激素受体在肝癌发生过程中的表达及意义

为了进一步探讨雄激素受体（ＡｎｄｒｏｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒ,ＡＲ）作为肝癌标志物的意义,本文采用免疫组织化学ＡＢＣ法,对二乙基亚硝胺（ＤＥＮ）诱发大鼠肝癌发生过程中肝细胞雄激素受体（ＡＲ）的表达进行了系统观察。结果显示：正常大鼠的ＡＲ阳性肝细胞极少,ＤＥＮ诱癌第４周可见少量肝细胞呈ＡＲ阳性表达,细胞散在分布,胞质和／或胞核内可见棕褐色阳性反应颗粒。随着肝癌发展进程,ＡＲ阳性肝细胞数逐渐增多,呈簇状或片状分布。至诱癌第１８周,肝癌结节内肝癌细胞大多呈ＡＲ阳性表达。本实验结果表明,ＡＲ与肝癌的发生和发展具有密切关系     

Bax蛋白在大鼠肝癌发生过程中的表达和意义

通过动态观察Bax蛋白在实验性大鼠肝癌发生过程中肝细胞的表达,探讨Bax蛋白与肝癌发生的关系及其生物学意义。用DEN饲喂大鼠,分别于第4、8、12、16、18周处死大鼠,取其肝脏,石蜡切片,ABC法免疫组织化染色。结果显示：正常成年大鼠肝细胞均有中等程度Bax蛋白表达。至诱癌第4周大鼠肝小叶内有少数肝细胞呈Bax蛋白免疫阳性反应,随诱癌发展进程,呈Bax蛋白免疫阳性反应肝细胞进一步减少,第12周,只可见肝细胞增生结节的多数肝细胞呈Bax蛋白免疫阳性反应。诱癌晚期（第18周）,癌结节内肝癌细胞均呈Bax免疫反应阳性,其强度较正常肝细胞明显增强,Bax蛋白免疫反应产物为胞质内粗大的棕褐色颗粒。部争肝细胞胞质和胞膜均呈阳性,肝癌细胞最为常见。结果表明：Bax蛋白表达减少或缺失是肝癌发生过程中的早期事件,可能参与肝癌的启动过程。     

在大鼠肝癌发生过程中GABA-BR1的表达变化及意义

为探讨γ-氨基丁酸B型受体1(γ-aminobutyric acid type B1 receptor,GABA-BR1)与肝癌发生的关系,利用二乙基亚硝胺(DEN)制备诱发型大鼠肝癌模型,模拟人类肝癌发生发展过程,采用免疫组织化学技术对GABA-BR1和细胞周期素E(Cyclin E)蛋白在大鼠肝脏中的表达进行定性和定量分析.结果显示,在正常肝组织中有少量散在分布的GABA-BR1表达阳性的细胞;在变性或坏死灶周围GABA-BR1表达阳性的肝细胞较多;增生结节中部分肝细胞呈过表达;在肝癌细胞中广泛表达.Cyclin E与GABA-BR1阳性表达的细胞分布特点相似.实验结果提示,在肝癌发生发展过程GABA-BR1过表达,可能对肝细胞的异常增生或癌变过程起到抑制作用.     

HPI在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞特异性抑增殖效应研究

肝细胞增殖抑制因子（Ｈｅｐａｔｉｃｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ,ＨＰＩ）粗制品、半纯品和纯品对体外培养的人肝癌细胞具有显著抑增殖作用,随样品纯度提高抑制活性逐渐增强。纯品（浓度５μｇ／ｍｌ）的抑制率达７７．７１％。正常成年大鼠肝细胞呈ＨＰＩ阳性表达。在ＤＥＮ诱发大鼠肝细胞癌的发生发展过程中,转化的癌前期细胞和肝癌细胞呈ＨＰＩ阴性表达。表明肝细胞ＨＰＩ的表达能力在其癌变过程中消失,从而失去了自身的抑癌作用。     

大鼠Walker-256移植性肺癌模型的建立

目的建立大鼠Walker-256移植性肺癌模型,探讨应用Walker-256癌细胞建立大鼠移植性肺癌模型的可行性。方法 SD大鼠经尾静脉注射高、中、低三种不同细胞浓度的大鼠Walker-256细胞悬液,观察大鼠的生存时间、体重变化、移植性肺癌模型的成模率,其他脏器转移情况及病理形态学变化情况。结果注射癌细胞后14 d,模型组大鼠均出现体重下降、摄食减少等体征,与正常对照组比较体重明显降低（P〈0.05）;注射癌细胞后21d,高浓度组大鼠开始出现死亡;高、中、低三组不同细胞浓度的移植性肺癌成模率分别为100%、80%、30%,模型组大鼠肝脏系数和肺脏系数均高于正常对照组。病理结果显示,模型组大鼠肺部可见明显的癌症病灶,而其他脏器未发现明显异常。结论注射高浓度Walker256癌细胞（3×105个细胞/只）能成功复制移植性肺癌模型,为移植性肺癌模型的建立和应用提供实验依据。     

抗VEGFR-2嵌合Fab抗体对裸鼠肝癌原位移植瘤新生血管生成的影响

目的:检测抗VEGFR-2嵌合Fab抗体对裸鼠肝癌原位移植瘤血管生成的影响.方法:建立裸鼠肝癌H22细胞原位移植瘤模型,随机分成生理盐水组(n=12)和抗体组(n=12).采用免疫组织化学SP染色法对两组肝脏移植瘤进行血管染色,观察其微血管密度(MVD)情况.结果:成功建立裸鼠H22肝癌原位移植瘤模型,HE染色显示肝脏移植瘤为肝细胞肝癌,免疫组化结果显示肝脏实体瘤内微血管密度抗体组较生理盐水组显著性减少(25.64± 1.53 vs 8.65± 1.79,P＜0.05).结论:抗VEGFR-2嵌合Fab抗体能够抑制裸鼠肝癌原位移植瘤的血管生成.     

近交系小鼠移植性肝癌模型建立及对比分析

目的：通过对比分析选择建立原位移植性肝癌模型的最佳小鼠品系。方法选取C57、C3H和BALB／c各10只小鼠分别作为模型组Ⅰ、模型组Ⅱ和模型组Ⅲ,沿腹中线开腹后将H22细胞接种到各模型组小鼠肝脏实质内。于注射后第15天剖腹探查,观察各组成瘤率,测量腹水量和肿瘤体积,并进行肿瘤病理学分析。结果三组小鼠存活率均为100％,15天后三组小鼠均产生腹水,但三组腹水量之间不具有统计学差异。模型组Ⅰ小鼠肝癌移植成功率为100％,高于模型组Ⅱ的60％和模型组Ⅲ的30％。模型组Ⅰ小鼠肝脏肿瘤全部为大块紧实灰白色病灶,其肿瘤平均体积显著大于模型组Ⅱ和模型组Ⅲ（ P＜0.05）。病理结果证实三组小鼠肝脏的灰白色病灶均为原位肝细胞癌。结论 C57小鼠是复制原位移植性肝癌模型较为理想的实验动物,为今后研究原位肝癌的发病机制提供良好的实验平台。     

衰老标记蛋白30 mRNA在癌细胞中的表达研究

目的:检测衰老标记蛋白(SMP)30 mRNA在不同癌细胞系中的表达情况,探讨其在不同细胞中的表达差异。方法:分别采用RT-PCR与荧光定量PCR检测SMP30 mRNA在正常肝细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞中的表达,并用SPSS13.0进行统计学分析。结果:SMP30 mRNA在所有被检测的细胞株中均有表达,在癌细胞中的相对表达量分别为肝癌细胞(0.926±0.340)、胃癌细胞(0.922±0.379)、乳腺癌细胞(0.614±0.356)、宫颈癌细胞(0.608±0.346),而在正常肝细胞中为0.175±0.158,显示SMP30 mRNA在癌细胞中的表达量较正常肝细胞中高(P0.05),且在肝癌细胞中的表达量比在其他癌细胞中更高。结论:SMP30 mRNA在癌细胞中的表达高于正常肝细胞,且在肝癌细胞中的表达高于其他癌细胞,具有临床应用价值。     

糖尿病血糖波动模型致大鼠海马体的炎性损伤

目的探讨血糖波动对糖尿病大鼠海马体造成的炎性损伤。方法用链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）和葡萄糖制备SD大鼠糖尿病模型（M组）和持续高血糖模型（MS组）,并错时腹腔注射给予葡萄糖、胰岛素制备糖尿病血糖波动大鼠模型（MF组）。血糖波动造模第6周时,测定大鼠一般生理学指标,血糖（glucose,Glu）、甘油三酯（triglyceride,TG）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL-C）和高密度脂蛋白（high density lipoprotein,HDL-C）等血液生化指标;同时采用荧光定量PCR法检测大鼠海马体中IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α等炎性因子mRNA的表达,Morris水迷宫试验检测血糖波动对糖尿病大鼠学习和空间记忆功能的影响。结果 （1）血糖波动造模第6周时,M组、MS组及MF组大鼠体质量显著低于N组（P〈0.01）,M组、MS组及MF组之间在1%极显著水平下无差异（P〉0.01）。（2）尾静脉注射STZ 1周后,M组、MS组、MF组的Glu、TG、LDL-C都有显著性的提高（P〈0.01）,HDL-C显著性下降（P〈0.01）。（3）与正常组比较,各模型组海马组织的IL-1β、IL-6、IL-8以及TNF-α均呈现显著性变化（所有P〈0.05）,组间IL-2水平则差异无显著性（P〉0.05）。其中,血糖波动模型MF组IL-1β和TNF-α水平的变化最大,达到极显著水平（P〈0.01）,并显著高于M组和MS组水平（P〈0.01）。尽管IL-2水平在各组间无统计学上的差异显著,仍可见血糖波动模型MF组中表达水平最低。（4）M组、MS组、MF组的逃避潜伏期、经过平台的次数以及在平台象限内的游泳距离与N组相比均呈极显著提高（所有P〈0.01）,其中血糖波动模型MF组的逃避潜伏期和过平台次数显著高于M组和MS组（P〈0.01）,提示MF组空间定位和记忆功能受损最严重,平台象限内的游泳距离在三种糖尿病模型组间差异无显著性（P〉0.05）。结论相较急性高血糖和慢性持续性高血糖而言,波动性高血糖对大脑海马体造成的炎性损伤以及功能影响更为严重。     

大小承气汤制作大鼠脾虚肝癌模型的比较

目的探索大小承气汤为基础的多因素大鼠脾虚模型和脾虚肝癌模型的制作方法和成模差别。方法采用苦寒泻下、寒湿环境、劳累、隔天禁食的方法制作脾虚大鼠模型,其中苦寒泻下因素采用大承气汤和小承气汤分别干预;Walker256大鼠肝癌细胞经裸鼠皮下增殖后移植入大鼠肝脏,制作肝癌模型。大鼠随机分为正常组、空白肝癌组、大承气汤组、小承气汤组,每组15只3周龄Wistar雄性大鼠,脾虚因素干预30 d后恢复7d制作肝癌模型并观察35 d。实验过程中观察动物脾虚程度、体重变化、成瘤情况、生存时间等。结果大、小承气汤组动物在脾虚造模过程中相对于对照组(P0.01),体重增长受到明显抑制,脾虚造模前20 d大承气汤组动物体重均高于小承气汤组(P0.05),之后二者无差别(P0.05)。大、小承气汤组动物平均脾虚积分高于空白肝癌组,小承气汤组最高(P0.01)。肝癌模型总成瘤率91.1%,空白肝癌组为80%,大、小承气汤组均为93.3%。小承气汤组大鼠平均生存天数小于肝癌组和大承气汤组(P0.01和0.05)。生存分析提示脾虚积分高的肝癌模型和小承气汤组肝癌模型的生存能力明显下降(P0.05)。结论小承气汤在多因素制作脾虚模型过程中致脾虚作用比大承气汤强,脾虚明显是肝癌模型预后不良的重要因素。     

异甘草酸镁对纤维化大鼠肝脏TGF-β 1及Smad蛋白表达的影响

目的：观察异甘草酸镁对四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝脏组织TGF-β1及Smad蛋白表达的影响,以期揭示其抗纤维化的机制。方法：利用腹腔注射四氯化碳（CCl4）建立大鼠肝纤维化模型,然后应用不同剂量的异甘草酸镁和INF-γ处理,于实验第16周末检测大鼠血清透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、III型前胶原（PC-III）、IV型胶原（C-IV）的水平,采用RT-PCR法检测TGF-β1,Smad3,Smad7mRNA的表达。结果：与模型组比较,异甘草酸镁各剂量组血清HA,LN,PC-III,C-IV水平显著下降（P〈0.05）,肝脏TGF-β1、smad3的表达明显降低（P〈0.05）,smad7则有所上升。结论：异甘草酸镁可以改善肝纤维化大鼠肝组织纤维化程度,其作用机理与抑制TGF-β1、Smad3mRNA的表达,上调Smad7mRNA的表达有密切关系。     

Sonic hedgehog induces the segregation of patched and smoothened in endosomes

BACKGROUND: Sonic hedgehog (Shh) signal transduction involves the ligand binding Patched1 (Ptc1) protein and a signaling component, Smoothened (Smo). A select group of compounds inhibits both Shh signaling, regulated by Ptc1, and late endosomal lipid sorting, regulated by the Ptc-related Niemann-Pick C1 (NPC1) protein. This suggests that Ptc1 regulates Smo activity through a common late endosomal sorting pathway also utilized by NPC1. During signaling, Ptc accumulates in endosomal compartments, but it is unclear if Smo follows Ptc into the endocytic pathway.RESULTS: We characterized the dynamic subcellular distributions of Ptc1, Smo, and activated Smo mutants individually and in combination. Ptc1 and Smo colocalize extensively in the absence of ligand and are internalized together after ligand binding, but Smo becomes segregated from Ptc1/Shh complexes destined for lysosomal degradation. In contrast, activated Smo mutants do not colocalize with nor are cotransported with Ptc1. Agents that block late endosomal transport and protein sorting inhibit the ligand-induced segregation of Ptc1 and Smo. We show that, like NPC1-regulated lipid sorting, Shh signal transduction is blocked by antibodies that specifically disrupt the internal membranes of late endosomes, which provide a platform for protein and lipid sorting.CONCLUSIONS: These data support a model in which Ptc1 inhibits Smo only when in the same compartment. Ligand-induced segregation allows Smo to signal independently of Ptc1 after becoming sorted from Ptc1/Shh complexes in the late endocytic pathway.     

肝组织中NF-κB、TGF-β1及其Ⅰ型受体mRNA和HSC在肝纤维化中的改变及护肝片对其的影响

目的探讨中、晚期纤维化大鼠肝组织中肝星状细胞(HSC)的活化与增殖、核转录因子-κB(NF-κB)及转化生长因子-β1(TGF-β1)及其Ⅰ型受体(TβRⅠ)表达的改变及护肝片对其的影响。方法采用12.5%CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型,自造模之日起,大鼠分组灌胃给药(护肝片921mg/kg)或溶媒,每日一次,直至8或13周末,分别处死动物,取左叶肝组织石蜡包埋,制作组织芯片。免疫组化S-P法检测大鼠肝组织α-平滑肌肌动蛋白(-αSMA)和NF-κB p65蛋白的表达,原位杂交检测TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达;并用MetaMorph图像分析系统计数-αSMA阳性细胞数,对NF-κB p65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达量进行定量分析。结果 1.模型复制8周和13周,模型组的肝损伤及其纤维化分级均明显高于正常组(P<0.01),护肝片组的肝损伤及其纤维化分级均轻于模型组。2.模型复制8周和13周,模型组活化的HSC(即-αSMA阳性细胞)数量较正常组明显增多,NF-κB p65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达均较正常组明显增强(P<0.01);3.护肝片显著抑制8、13周纤维化肝组织HSC的活化与增殖和NF-κB p65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达(P<0.01)。结论抑制HSC的活化与增殖和NF-κB p65蛋白与TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达可能是护肝片抗肝纤维化作用的靶点之一。