丙型肝炎病毒多表位抗原基因的构建与免疫原性研究

丙型肝炎病毒(HCV)基因易发生变异, 尤其是含中和抗原表位的高变区1(HVR1)变异性最大. 模拟HVR1的B细胞表位具有涵盖多种天然表位的抗原特性, 保守的T细胞表位具有各型间的相对保守性. 为解决HCV高变性造成的疫苗研究障碍, 我们选取HCV E2区HVR1(384～410 aa)模拟B细胞表位9条、C区的保守CTL表位2条(35～44 aa, 132～140 aa)、NS3区保守的CTL表位1条(1073～1081 aa)及NS3区保守的Th表位1条(aa 1251～1259), 各表位之间以插入3个氨基酸为连接臂, 人工合成上述13条表位基因串联的HCV多表位抗原基因(mfc). 将mfc与gst基因融合, 表达了多表位抗原蛋白GST-MFC. 同时, 构建了白介素-2信号肽基因、PADRE表位基因和mfc基因串联的候选HCV DNA疫苗, 即质粒pVAX1.0-st-mfc. 以GST-MFC蛋白免疫家兔和质粒pVAX1.0-st-mfc免疫小鼠, 采用ELISA和Western blot方法, 应用10条具有代表性的HCV HVR1合成肽进行检测, 证明有9条HVR1合成肽能与所有免疫动物血清反应, 交叉反应率(cross reactivity, CR)为90%. 应用HCV抗体阳性的感染者血清与多表位抗原GST-MFC蛋白进行反应, 证明其反应识别率(reactivity frequency, RF)为75%. 上述结果表明, 筛选合成的HCV多表位抗原基因mfc具有HCV中和抗原表位的特征, 可作为HCV疫苗研制的候选基因.     

丙型肝炎病毒NS3蛋白辅助T细胞表位研究

对2例HCV持续性感染者2个时间点NS3区C末端克隆测序,研究HCV NS3蛋白一个辅助T细胞表位(氨基酸位1248-1261)在HCV感染者体内的保守性;人工合成该表位进行淋巴细胞增殖试验和抑制试验,观察该表位引起免疫应答的水平和特点;通过"刺激-休息-刺激"多轮循环建立该表位特异性的T细胞系,并用流式细胞仪鉴定表型.结果发现该表位在2个病人2个时间点均未变化;观察的2例HCV持续性感染者和1例感染恢复者均对该表位有较强CD4+T细胞应答.建立了针对该表位的表型均一的CD4+辅助T细胞系.本研究提示该表位是一个序列保守的强辅助T细胞表位,对HCV T细胞疫苗的研制有一定意义.     

在哺乳动物细胞中表达丙型肝炎病毒结构蛋白的研究

应用带有T7启动子的痘苗载体构建了含丙型肝炎病毒 (HCV)结构蛋白基因C ,E1和E2 /NS1的重组痘苗表达克隆 .在重组痘苗病毒vTT7所提供的T7RNA聚合酶存在下 ,在哺乳动物细胞中进行了暂时表达 .以HCV患者血清作Westernblot鉴定 ,分别检测到了核心蛋白C、包膜蛋白E1和E2的成熟表达 ,并且发现表达产物与不同来源的HCV患者血清及克隆本病毒患者不同时期的抗血清反应不同 .比较了C- E1 -E2在 6种不同的哺乳动物细胞中的表达情况 ,其中Vero和HeLa细胞对于这些蛋白的表达最为理想 .为了对表达产物开展进一步的研究 ,已成功地构建了能稳定表达C ,E1和E2的重组痘苗病毒株 .     

HCVNS3基因片段酵母展示文库的构建和鉴定

 HCV NS3特异的 CD4+T细胞反应与 HCV感染的良性转归相关 .为了筛选其 CD4+T细胞表位 ,构建了 HCV NS3基因片段酵母展示文库 .首先 DNase 不完全酶切 HCV NS3基因产生长度为 1 0 0～ 30 0 bp的随机片段 ,然后在它们两端加上含限制性内切酶 Bam H 作用位点的接头 ,再以接头序列作引物进行 PCR扩增 .最后扩增产物用 Bam H 酶切后与 Bam H 线性化的穿梭载体 p YD1连接 ,转化大肠杆菌 (E.coli) DH5α,共得到 2× 1 0 6个转化子 .转化菌落的 PCR扩增结果表明 ,约 50 %转化子含插入片段 .随机选择 5个插入片段测序 ,然后与 DNA序列数据库中的序列比较 .结果显示它们分别与 HCV NS3序列有 96%～ 99%的同源性 .用从转化菌落中提取的质粒转化酵母 (S.cerevisiae)菌株 EBY1 0 0 ,得到含 2× 1 0 5个插入片段的 HCV NS3基因片段酵母展示文库 .半乳糖诱导的酵母细胞通过和 FITC标记的抗体结合 ,用 FACS可以在 2 0 %的细胞表面检测到融合蛋白的表达 .     

应用噬菌体随机肽库技术筛选丙肝病毒NS3抗原模拟表位

以抗-HCV NS3的单克隆抗体作为固相筛选分子,对人工合成的噬菌体随机12肽库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选过程,随机挑取42个克隆,经噬菌 体酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定并进行交叉反应实验以及竞争抑制性结合实验,最后对所选克隆进行DNA序列分析,以确定HCV NS3抗原的模拟表位.经噬菌体富集后,从随机筛选的 42个克隆中得到11个阳性克隆,确定氨基酸序列XXIXXXXMSNXX为HCV NS3的模拟表位.我们用噬菌体12肽库成功筛选得到HCV NS3的模拟表位,为开展用HCV模拟表位探索HCV的防治研究创造了条件.     

脂多糖保守表位模拟肽的筛选与鉴定

用针对脂多糖保守表位的单抗2B4对噬菌体随机12肽库进行亲和筛选,通过噬菌体ELISA实验及脂多糖(LPS)竞争抑制实验鉴定阳性克隆.经三轮筛选后,与抗体结合的噬菌体得到明显富集,噬菌体ELISA结果显示,阳性率达80%.将其中12个阳性噬菌体克隆做鼠伤寒杆菌和大肠杆菌LPS竞争抑制实验,抑制作用非常明显,有良好的剂量依赖关系,证明这12个克隆与LPS具相似表位.DNA测序并推导噬菌体展示肽的氨基酸序列为,GPPQWFFSQPQL（5/12,41.7%）,LPQYFWNTATTA （3/12,25%）,FPQNHWNVPWAT（2/12,16.6%）,HSQSFWNAPLAM和AHPWTHGYFPPL（1/12,8.3%）.实验结果表明,用2B4抗体筛选到的噬菌体短肽克隆可模拟保守表位,即脂多糖的模拟肽（位）.     

脂多糖保守表位模拟肽的筛选与鉴定

用针对脂多糖保守表位的单抗2B4对噬菌体随机12肽库进行亲和筛选,通过噬菌体ELISA实验及脂多糖(LPS)竞争抑制实验鉴定阳性克隆.经三轮筛选后,与抗体结合的噬菌体得到明显富集,噬菌体ELISA结果显示,阳性率达80%.将其中12个阳性噬菌体克隆做鼠伤寒杆菌和大肠杆菌LPS竞争抑制实验,抑制作用非常明显,有良好的剂量依赖关系,证明这12个克隆与LPS具相似表位.DNA测序并推导噬菌体展示肽的氨基酸序列为,GPPQWFFSQPQL（5/12,41.7%）,LPQYFWNTATTA（3/12,25%）,FPQNHWNVPWAT（2/12,16.6%）,HSQSFWNAPLAM和AHPWTHGYFPPL（1/12,8.3%）.实验结果表明,用2B4抗体筛选到的噬菌体短肽克隆可模拟保守表位,即脂多糖的模拟肽（位）.     

中国人血清中丙型肝炎病毒聚合酶全长基因的克隆表达及鉴定

构建中国人丙型肝炎病毒(HCV)复制的RNA聚合酶原核表达载体pET30aNS5b,并在大肠杆菌中获得NS5B聚合酶蛋白的高效表达,为建立HCV NS5b聚合酶细胞外分子复制模型的方法创造条件.使用高保真Pfu DNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增,从我国HCV RNA阳性血清中扩增出HCV NS5b RNA多聚酶全基因序列,经BamHI 和SalI酶切,将其克隆至同样酶切的 pET-30a载体中;转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达.用抗 HCV NS5b单克隆抗体做Western-Blot进行鉴定.结果表明构建了原核表达载体,pET30aNS5bpET30aNS5b明显表达出12-His-NS5b聚合酶蛋白.测序结果表明,与已发表的相关HCV NS5b RNA聚合酶序列比较,其核苷酸和氨基酸的同源性分别在69%～92.7%及88.8%～96.8%之间.在最佳表达条件下,可高效诱导表达融合蛋白(65kDa),最高表达量占菌体蛋白18.9%.Western-Blot结果显示表达蛋白为HCV NS5b酶.HCV聚合酶蛋白全长基因可以成功地克隆在pET-30a载体上并有效表达出目的蛋白,为研究建立HCV NS5b聚合酶细胞外分子复制模型奠定了基础.     

猪瘟病毒糖蛋白E^rns中和表位的鉴定和比较

猪瘟病毒 (CSFV)囊膜结构糖蛋白Erns(gp4 8)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的第二抗原蛋白。E2和Erns与细胞表面受体的相互作用介导CSFV感染细胞的过程。Erns具有RNA酶活性 ,影响病毒自身复制并涉及对病毒的中和效应。采用抗CSFValfortT櫣ｂｉｎｇｅｎ毒株Ｅｒｎｓ糖蛋白的 1B5 ,b4_2 2和 2 4 16单克隆中和抗体 ,筛选噬菌体展示的 12肽随机肽库 ,进行Erns中和表位的鉴定和比较 ,获得分别针对 1B5、b4_2 2和 2 4 16单克隆抗体的 3个主要中和表 (拟 )位基序WxNxxP、DKNR (Q)G和A(T)CxYxKN ,分别定位于Erns的 35 1位～ 35 6位或 348位～ 35 0位、384位～ 386及 32 2位～ 32 3位、380位～ 386位氨基酸区域。分析表 (拟 )位基序与单克隆抗体的免疫反应性差异。b4_2 2和 2 4 16单克隆抗体识别基序存在共有序列KN ,识别Erns中的相似抗原区 ,但其侧翼序列及免疫印迹、免疫荧光抗体抑制试验结果均存在显著差异     

猪瘟病毒糖蛋白Erns中和表位的鉴定和比较

猪瘟病毒（CSFV）囊膜结构糖蛋白Erns（gp48）是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的第二抗原蛋白。E2和Erns与细胞表面受体的相互作用介导CSFV感染细胞的过程。Erns具有RNA酶活性,影响病毒自身复制并涉及对病毒的中和效应。采用抗CSFV alfort Tübingen 毒 株Erns糖蛋白的1B5, b4_22 和24/16单克隆中和抗体,筛选噬菌体展示的12肽随机肽库,进行Erns中和表位的鉴定和比较,获得分别针对1B5、b4_22 和24/16单克隆抗体的3个主要中和表（拟）位基序WxNxxP、DKNR (Q) G和 A（T）CxYxKN,分别定位于Erns的351位～356位或348位～350位、384位～386及322位～323位、380位～386位氨基酸区域。分析表（拟）位基序与单克隆抗体的免疫反应性差异。B4_22 和 24/16单克隆抗体识别基序存在共有序列KN, 识别Erns中的相似抗原区,但其侧翼序列及免疫印迹、免疫荧光抗体抑制试验结果均存在显著差异。