四株草鱼呼肠孤病毒毒株的细胞感染特性比较研究

本文首次对低温保存的三株草鱼呼肠孤病毒GCRV873 、GCRV875、GCRV876与新分离的GCRV991毒株进行了细胞培养与病毒感染特性等比较研究。结果表明 ,GCRV873 、GCRV875、GCRV876在 - 30℃保存 10年后仍然具有一定的感染性 ,其滴度均在 10 2 TCID50 /mL以上 ,略低于从病鱼组织分离的GCRV991毒株的滴价。经传代培养后 ,四株GCRV的毒力逐渐升高 ,并趋于稳定 ;当感染复数 (MOI)为 0 .0 5PFU/cell时 ,测定四株GCRV的滴度均高于 10 8TCID50 /mL ,但略有差异。GCRV873 的滴度最高 ,可达到 6 .4× 10 11TCID50 /mL。连续传代的GCRV毒株在不同温度 (2 8℃、31℃、34℃、37℃、41℃ )条件下 ,均可感染CIK细胞 ;在 2 8℃时 ,感染效价最高 ,随着温度的升高 ,其感染效价逐渐降低     

三株草鱼出血病病毒免疫原性的比较

从湖南邵阳、湖北仙桃、武汉南湖地区分离到的三株草鱼出血病病毒(GCHV873、GCHV875、GCHV876),分别对家兔进行免疫,并测定了它们在家兔体内形成抗体的水平以及这些抗体对相应抗原的中和能力。实验结果显示:GCHV873产生抗体滴度比GCHV875高一倍,较GCHV876高8倍;其抗体的中和效价分别是1:1778(10~(-3.25))、1:386(10~-(2.59))和1:181(10~-(2.25))。上述结果表明:GCHV873的免疫原性是三个分离株中最强的一个毒株。     

草鱼呼肠孤病毒新分离株(GCRV991)的病毒学特性分析

从湖南长沙分离到一株致病性强的草鱼呼肠孤病毒(GCRV991),该病毒能使草鱼CIK,肥头鲤FHM细胞产生明显的CPE,对水生动物BF2,EPC及哺乳动物BHK,VERO细胞株不敏感.中和实验显示,GCRV873抗体能有效地中和GCRV991病毒颗粒,形成抗原抗体免疫复合物.纯化的病毒核酸与蛋白经SDS-PAGE分离,分别呈现11条清晰的核酸带及5条主要与2条微量结构多肽图谱,其核酸蛋白分子量大小与GCRV873相近似.该毒株基因组总分子量为14.48×106kD,大小范围是0.55～2.61×106kD;5条主要与两条微量结构多肽分子量近似值分别为136kD、132kD、65kD、43kD、34kD及138kD、82kD.上述结果提示,新分离的GCRV991与GCRV873具有相似的抗原性.     

草鱼呼肠孤病毒新分离株（GCRV991）的病毒学特性分析

从湖南长沙分离到一株致病性强的草鱼呼肠孤病毒 (GCRV991) ,该病毒能使草鱼CIK ,肥头鲤FHM细胞产生明显的CPE ,对水生动物BF2 ,EPC及哺乳动物BHK ,VERO细胞株不敏感。中和实验显示 ,GCRV873 抗体能有效地中和GCRV991病毒颗粒 ,形成抗原抗体免疫复合物。纯化的病毒核酸与蛋白经SDS PAGE分离 ,分别呈现 11条清晰的核酸带及 5条主要与 2条微量结构多肽图谱 ,其核酸蛋白分子量大小与GCRV873 相近似。该毒株基因组总分子量为 14.48× 10 6kD ,大小范围是 0 .5 5～ 2 .6 1× 10 6kD ;5条主要与两条微量结构多肽分子量近似值分别为136kD、132kD、6 5kD、43kD、34kD及 138kD、82kD。上述结果提示 ,新分离的GCRV991与GCRV873 具有相似的抗原性     

建立H5N1流感病毒感染雪貂动物模型

目的建立甲型H5N1流感病毒感染雪貂动物模型[1-3]。方法 H5N1流感病毒株A/Vietnam/1203/2004病毒以103和104 TCID50滴度分别感染雪貂。对4～10月龄去势雪貂经兽用氯胺酮轻度麻醉后进行滴鼻感染,每个稀释度接种3只雪貂,感染后第5天安乐处死。感染后每天记录雪貂一般临床变化。感染前0 d采集鼻甲骨活检,感染后1～5 d鼻甲骨活检检测病毒载量和病毒滴度。处死时取雪貂气管、肺、心、肝、脾、肾、小肠、脑组织作病毒滴度检测和病理检查。结果 H5N1103和104 TCID50的病毒分别感染雪貂,雪貂死亡都率在33%。103TCID50和104 TCID50病毒分别感染雪貂,动物都出现持续3 d体温升高,104 TCID50组出现超过20%的体重下降。上呼吸道排毒呈现上升趋势,并可在除呼吸系统以外的组织器官中分离到病毒。感染的雪貂病理表现为重度肺炎。结论雪貂感染H5N1病毒株后在临床表现、病毒学、分子生物学、病理学方面的检测都可以证实雪貂感染H5N1病毒动物模型已建立,104 TCID50病毒滴度是一个建立感染动物模型比较合适的剂量。     

新型冠状病毒南非B.1.351变异株的分离与分子特征分析

2020年12月广州市第八人民医院收治了 1例南非输入性COVID-19病例,经检测为SARS-CoV-2核酸阳性的实验室确诊病例.本研究使用Vero-E6细胞,对该病例咽拭子样本进行病毒分离,逐日观察,咽拭子接种的细胞管3d开始出现细胞融合样细胞病变(Cytopathic effect,CPE),5d出现完全CPE后再进行第二代接种,2d出现病变,提取核酸进行鉴定,为SARS-CoV-2阳性.第2代复传的SARS-CoV-2病毒株TCID50测定结果为5.5log TCID50/0.1mL～5.8log TCID50/0.1mL.对分离毒株经采用三代测序成功获得全基因组序列,进化分析结果为与参考毒株Wuhan/Hu-1/2019相比共发生30个碱基的变异、18个氨基酸的突变和18个碱基的缺失,比对结果显示分离到的毒株为SARS-CoV-2南非B.1.351变异株.     

甲肝病毒在猴胚肾细胞和Vero细胞上的分离与适应

使用恒河猴胚肾(MEK)细胞从临床标本中分离和适应了甲肝病毒W和X,通过阻断实验、中和实验、免疫荧光和免疫电镜实验、RT-PCR对其进行特异性鉴定,证明是甲肝病毒.W株和X株第7代在MEK细胞上的抗原滴度分别为1∶512、1∶1024,感染滴度(logTCID50/mL)分别为8.17、8.50.只有分离株W可以适应于Vero细胞,第6代21d抗原滴度为1∶256,感染滴度(logTCID50/mL)为8.00.     

一株小鼠诺如病毒的分离和鉴定及全基因组序列分析

小鼠诺如病毒(Murine norovirus,MNV)属于杯状病毒科诺如病毒属成员,是2003年新发现的感染实验小鼠的病毒,也是目前已知的小鼠病毒中感染率最高的一种病毒。本研究利用RAW264.7细胞从MNV感染小鼠的盲肠内容物中进行病毒分离,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法、病毒空斑试验、TCID50试验、电镜观察、间接免疫荧光试验和测序分析等方法对分离到的病毒进行鉴定,结果显示RAW264.7细胞接毒24~48h后出现明显的细胞病变,表现为细胞圆缩、变亮、聚集,最后大部分细胞死亡脱落。分离株在RAW264.7细胞上传代至第2~3代时可出现稳定的细胞病变。经病毒空斑试验获得一株纯化病毒,病毒滴度TCID50为105.25/0.1mL。电镜观察可见明显的病毒颗粒,颗粒呈球形,无囊膜,直径约30~35nm。分离株经鉴定后命名为MNV Guangzhou/K162/09/CHN。采用RT-PCR技术分段扩增基因组开放阅读框(ORF),同时应用3′-RACE和5′-RACE技术扩增基因组的3′-UTR和5′-UTR,分别对扩增片段进行克隆和测序,经拼接后获得分离株全基因组序列。结果显示分离株基因组序列全长7 380个核苷酸(GenBank登录号:HQ317203),将分离株全基因组序列与GenBank登录的国外参考毒株进行同源性比较,结果表明该毒株与其他MNV分离株核苷酸同源性为87.4%~89.7%。基于VP1蛋白核苷酸序列绘制MNV毒株系统发生进化树,结果表明该分离株与来自日本(S7-P2和S7-PP3)、美国(CR3和CR18)、韩国(K4)和德国(Berlin/04/06/DE和Berlin/05/06/DE)的毒株进化距离较近,同属一个进化分支。本研究是国内首次对MNV病毒进行分离鉴定和全基因组序列分析的报道。     

雪貂感染流感病毒H3N2动物模型的建立

目的建立甲型流感病毒H3N2感染的雪貂动物模型。方法按实验要求筛选出流感抗体反应阴性的雪貂,经兽用氯胺酮轻度麻醉后进行滴鼻感染H3N2流感病毒株A/Brisbane/10/07,设立两个稀释度106和107 TCID50,每个稀释度接种3只雪貂,感染后第5天安乐处死。感染前采集鼻甲骨活检,感染后1～5 d鼻甲骨活检检测病毒载量,每天记录雪貂一般临床变化。处死时取雪貂肺、肝、脾、小肠、脑组织作病毒滴度检测,肺组织做病理检查。结果 106和107TCID50的H3N2病毒分别感染雪貂,没有雪貂死亡。雪貂感染后都出现一过性的体温升高,体重的下降,流涕、打喷嚏等症状。在鼻甲骨活检物中可测到病毒载量,肠组织可分离到病毒。肺组织以轻度性间质性肺炎为主要病理变化。结论雪貂感染H3N2病毒株A/Brisbane/10/07后,临床表现、病毒学、分子生物学、病理学方面的检测都可以证实雪貂感染H3N2病毒动物模型已建立,其中106 TCID50病毒滴度的是一个建立感染动物模型比较合适的剂量。     

RT-SHIV中国恒河猴适应株细胞水平生物学特性分析

目的体外增值、制备动物感染来源的RT-SHIV病毒中国恒河猴适应株,比较PBMCs和CEMx174两种细胞制备出病毒的差异,同时用TZM-bl、CEMx174、PBMC三种细胞滴定测定病毒TCID50。方法用RT-SHIV病毒静脉感染中国恒河猴,定期采血测定血浆病毒载量,当病毒载量达高峰时采血分离外周血单核淋巴细胞（PBMCs）,与正常恒河猴PBMCs或CEMx174细胞共培养,定期测定培养液中的P24抗原水平,当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存;测定病毒RNA载量、P24抗原浓度,滴定病毒的TCID50。结果本研究共制备了78 mL PBMCs来源的RT-SHIV病毒和85 mL CEMx174细胞来源的RT-SHIV病毒。RT基因序列和原始序列的相似度为99%,仅在第254和265位的氨基酸发现突变。RT-SHIV（PBMC）和RT-SHIV（CEMx174）病毒载量分别为1.641×108 copies/mL和8.375×108 copies/mL,P24抗原水平分别为20.745 ng/mL和4.28 ng/mL,TZM-bl、CEMx174、PBMC细胞测定病毒的TCID50分别为3.16×105 TCID50/mL和1×104 TCID50/mL,5×102 TCID50/mL和5×105 TCID50/mL,5×102 TCID50/mL和5×103 TCID50/mL。结论 PBMCs细胞来源制备的病毒较CEMx174制备的病毒具有更高的感染性。