工业酶结构与功能的构效关系

工业酶是绿色生物制造的"芯片",支撑着下游数十倍甚至百倍的产业。解析工业酶结构与功能关系是对其设计改造并应用于工业生产的基础。近年来随着蛋白结构解析技术和计算模拟技术的发展,酶结构与功能的构效关系得到更加深刻的认识,使得酶理性设计,甚至是从头设计成为可能。文中围绕酶结构的可塑性及其催化功能的多样性,综述工业酶结构与功能构效关系的研究进展及应用,并展望该领域的未来发展前景。     

甘油醛-3-磷酸脱氢酶结构的保守性

对中国南海龙虾等五种种属的甘油醛－３－磷酸脱氢酶晶体结构进行了比较,结果显示该酶三维结构的高度保守性。结构类似性包括酶活性中心、与辅酶结合部位、二级结构、结构域组织、亚基排列以及许多有序水结构。位于分子中心的Ｓ－ｌｏｏｐ区存在两种略有差别的构象,分别对应于耐热酶与不耐热酶。对其它细小的结构差别也进行了分析与讨论。     

苯丙氨酸解氨酶

苯丙氨酸解氨酶由四个亚基组成,含两个脱氢丙氨酸残基。植物酶具有内在不稳性,由多种同工酶组成。酶催化过程中发生构象变化,底物经过负碳离子中间体完成反应。该酶并非是二单体负协同变构酶。一级结构表明,酶以无规则卷曲结构为主。酵母基因约2.7kb,有六个内含子,编码75kD_a肽。植物酶由多基因编码,有一个内含子,编码78kD_a肽。启动子部位有两个富含A、C碱基的序列,为胁迫作用基因活化因子结合部位。     

重组琼胶酶rAgaN3基因的生物信息学分析

利用生物信息学软件和数据库对从Microbulbifer sp.BN中得到的琼胶酶rAgaN3全长基因进行预测分析,结果表明:重组琼胶酶rAgaN3理论分子量为31.243 kDa,理论等电为4.81,不稳定系数为26.23,脂肪系数为62.35,平均疏水性系数为-0.662,无跨膜结构域,无信号肽;二级结构表明该蛋白无螺旋结构,有15个折叠结构,其余均为卷曲结构;序列相似性分析表明,蛋白rAgaN3属于糖苷水解酶GH16家族,为β-琼胶酶;以同源蛋白3wz1A(同源性88%)为模板,通过同源建模构建出了蛋白三级结构,并用拉式图进行了结构检验。琼胶酶rAgaN3基因的生物信息学分析,为琼胶酶的异源表达提供了指导,为琼胶酶的定点突变、深入研究其结构和功能的关系打下良好基础。     

硫醌氧化还原酶研究进展

硫化物是一种广泛分布的有毒物质。硫醌氧化还原酶是生物体硫化物代谢的一种关键酶。对该酶的发现与分布、序列特征、催化机制、催化特性、三维结构和生理功能等几个方面进行概述,并对该酶未来研究方向进行展望。     

1株枯草芽胞杆菌的鉴定及其弹性蛋白酶结构研究

鉴定弹性蛋白酶产生菌株EL32,确定该酶的基本结构。采用分子生物学、形态学及生理生化性质对菌株EL32进行鉴定;用硫酸铵沉淀、离子交换层析和分子筛层析纯化酶蛋白;借助肽指纹图谱及酶基因克隆技术研究该酶的一级结构;利用同源建模的方法研究该酶的空间结构。菌株EL32的16S rDNA与枯草芽胞杆菌16S rDNA的同源性达到99%,其菌落呈乳白色,其细胞革兰染色阳性,具有芽胞;发酵葡萄糖试验产酸不产气,明胶水解试验呈阳性,能够水解淀粉,V-P反应呈阳性,鉴定为枯草芽胞杆菌。从菌株BL32发酵液中纯化得到了弹性蛋白酶,SDS-PAGE分析显示其分子量为31 ku。用LTQ-MS测定肽指纹图谱表明该弹性蛋白酶是枯草芽胞杆菌蛋白酶subtilisin,该酶的基因和蛋白质序列与枯草芽胞杆菌蛋白酶subtilisin的同源性都高达99%。菌株EL32弹性蛋白酶的三维结构含有6个α-螺旋,7个扭曲的平行β-折叠以及2个反平行的β-折叠,His、Asp和Ser是其活性中心的关键基团。鉴定了1株产弹性蛋白酶的枯草芽胞杆菌,确定了其弹性蛋白酶是蛋白酶subtilisin,为该枯草芽胞杆菌蛋白酶的应用提供了基础。     

胰蛋白酶消化法测定牛胶原蛋白三股螺旋结构的含量

本研究建立了一种测定胶原蛋白的三股螺旋结构含量的方法。该方法通过使用柱前衍生高效液相色谱(HPLC)法表征经胰蛋白酶酶解后胶原蛋白羟脯氨酸(Hyp)质量浓度的变化,进而对胶原蛋白的三股螺旋结构进行定量。探讨了不同的酶解时间(0~48h)、酶与底物的比例(1∶100、1∶50和1∶20)和温度(20、25、30、37℃)对明胶降解率的影响。获得了酶解的最佳条件——当胰蛋白酶与底物的比例为1∶50时,25℃酶解3h。使用该方法对明胶胶原蛋白混合液检测,结果表明,该方法能灵敏(RSD<10%)的测定胶原蛋白三股螺旋结构的含量。该方法不仅可用于生物组织研究领域,也可用于胶原蛋白食品、保健品和组织工程产品质量的评价。     

一种pH和热稳定的联苯水解酶的纯化及其特征

【目的】通过联苯水解酶的表达,纯化,化学修饰以及酶学性质研究,以期了解水解酶的结构和功能,为其定向改造,获得高效的和能够拓宽底物范围的新突变酶奠定基础。【方法】将水解酶基因在大肠杆菌BL21(Escherichia coli BL21)中进行异源表达,表达产物经离子交换层析以及凝胶层析后进行酶学特性研究,同时通过圆二色谱法对该酶二级结构与热稳定性之间的关系进行分析。【结果】经Q Sepharose和Sephacryl S-300两步纯化获得了电泳纯的联苯水解酶(biphenyl hydrolase,BphD),SDS-PAGE鉴定其单体为31 kDa,Sepharose 12凝胶柱层析分析其为四聚体。该酶最适反应温度和最适pH分别为80℃和9,在pH4-11的缓冲液中酶活相对稳定。该酶在60℃温浴1 h,酶活剩余90%,而在70℃温浴时,半衰期为1 h,是迄今为止在红球菌中报道的唯一一例热稳定性高的水解酶。圆二色谱显示该酶以α-helix占主导地位,当温度升高到70℃时,其二级结构发生了明显的变化,75℃和80℃时BphD的结构已经遭到严重的破坏。序列比对表明:Ser,His,Asp以及Trp残基在几种同源水解酶中相对保守。化学修饰表明Ser,His,Asp在R04水解酶催化底物水解过程中担任重要角色,Trp残基可能位于酶的活性中心,并作为关键氨基酸参与底物的水解过程。【结论】获得了电泳纯的BphD,其pH稳定性以及耐高温特性在同源水解酶中较为罕见,色氨酸关键氨基酸的地位也为进一步了解该酶转化底物的机制奠定了一定的基础。     

植物细胞质膜H+-ATPase的结构与功能

植物细胞质膜H+-ATPase属于P型质子泵。由该酶产生的跨膜电化学梯度是物质跨膜运输的原初动力。研究表明,质膜H+-ATPase与植物的生长发育密切相关,被称为植物细胞的“主宰酶”。近年,关于该酶的生化特性,基因表达与调控以及结构与功能等方面的研究取得重要进展。对质膜H+-ATPase的生化特性,分子结构,调节机制和生理功能等进行了综述。     

RubisCO的研究进展

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)是调节光合和光呼吸,决定净光合作用的一个关键酶;也是植物可溶性蛋白质中含量最高的蛋白质.该酶广泛存在于植物及一些微生物体内.综述了近年来有关RubisCO的一些研究进展. 包括RubisCO的基本性质、结构与功能、酶基因工程、酶活性调节及其活化酶等.     

产甲烷古菌铁氢酶研究进展

根据活性中心金属原子的不同,氢酶主要分为镍铁、铁铁、铁氢酶三大类。铁氢酶是发现较晚、存在物种单一且结构较为特殊的一类氢酶。目前,铁氢酶仅发现于氢营养型产甲烷古菌中。该酶直接催化氢气异裂,还原产甲烷代谢途径中一碳载体四氢蝶呤的次甲基转化为亚甲基。与其他两类氢酶相比,铁氢酶不含传递电子的铁硫簇和双金属活性中心,在结构组成上有较大的差异。此外,铁氢酶活性中心的吡啶环被高度取代,活性中心铁原子直接与酰基碳成键,这些奇特的活性分子结构预示着氢酶全新的催化机制,以及古菌细胞在合成特殊结构大分子方面的特殊功能。本文总结了从1990年发现这类新型氢酶以来的相关研究,分别从氢酶的生理功能、结构特征、催化机制、成熟过程及应用研究等方面阐述铁氢酶的研究进展。     

荧光素酶及其应用

介绍了细菌荧光素酶基因(lux)和萤火虫荧光素酶基因(luc)的结构特点和二者的差异,概述了该酶作为报告基因在基础研究和实践(污染物监测、急性毒性和遗传毒性监测、微生物监测等)中的应用,肯定了该酶作为报告基因的广阔应用前景。     

植物细胞质膜H+-ATPase的结构与功能

植物细胞质膜Ｈ＋ＡＴＰａｓｅ属于Ｐ型质子泵。由该酶产生的跨膜电化学梯度是物质跨膜运输的原初动力。研究表明,质膜Ｈ＋ＡＴＰａｓｅ与植物的生长发育密切相关,被称为植物细胞的“主宰酶”。近年,关于该酶的生化特性,基因表达与调控以及结构与功能等方面的研究取得重要进展。对质膜Ｈ＋ＡＴＰａｓｅ的生化特性,分子结构,调节机制和生理功能等进行了综述     

抗冻蛋白结构基因片段的克隆

为了研究和开发利用抗冻蛋白或多肽,木文通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）合成了抗冻蛋白１１０ｂｐ的结构基因片段,然后将该基因片段克隆到大肠杆菌质粒载体Ｐ（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）Ⅱｋｓ＋／－上,获得了重组质粒,经酶切证明,获得的重组质粒中含有抗冻蛋白结构基因片段,以供该基因在大肠杆菌或酵母中表达抗冻蛋白。     

麻疯树脂酶全长基因克隆、表达及其蛋白质结构预测

脂酶(Lipase, EC3.1.1.3)是普遍应用于皮革、饲料及生物柴油工业的工业酶制剂, 具有广泛的应用价值。目前对植物来源的脂酶研究较少。本研究用在生物柴油中具有应用前景的油料植物——麻疯树(Jatropha curcas)作为研究对象, 克隆了该物种的脂酶基因(JcLIP)。通过多序列比对并结合物种的亲缘关系设计了具有较高特异性的简并引物, 通过使用RT-PCR和RACE技术, 最终获得了麻疯树脂酶基因的全长序列并成功地在大肠杆菌中表达, 酶活测定结果表明, 麻疯树脂酶在大肠杆菌中表达在包涵体中, 但是能产生具有活力的蛋白质, 酶活约为0.8 U.mL-1。结构预测和比较表明, JcLIP蛋白质具有脂酶的结构核心和催化活性中心, 而在非核心区具有较毛霉脂酶更多的插入和随机卷曲, 这可能是决定二者之间酶活差异的重要原因。     

酶祖先序列重建与定向进化

酶祖先序列重建是指通过计算机算法推导来自灭绝生物的祖先酶的氨基酸序列的技术。通常可分为6个步骤,依次为现代酶的核酸/氨基酸序列收集、多序列比对、系统发育树构建、祖先酶序列的计算机推测、基因克隆、酶学性质表征。该方法广泛应用于研究分子在行星时间尺度上对环境条件不断变化的适应性和进化机制。随着酶在生物催化领域中扮演越来越重要的角色,该方法逐渐成为研究酶序列、结构和功能关系的有力手段。同时,祖先酶大多具有温度稳定性、突变稳定性等特性,使其成为进一步定向进化的理想蛋白质支架。文中综述了酶祖先序列重建的计算机算法、应用和常用计算机软件,并结合最新研究进展,展望其在酶定向进化领域中的应用前景。     

麻疯树脂酶全长基因克隆、表达及其蛋白质结构预测

脂酶(Lipase,EC3.1.1.3)是普遍应用于皮革、饲料及生物柴油工业的工业酶制剂,具有广泛的应用价值。目前对植物来源的脂酶研究较少。本研究用在生物柴油中具有应用前景的油料植物——麻疯树(Jatrophacurcas)作为研究对象,克隆了该物种的脂酶基因(JcLIP)。通过多序列比对并结合物种的亲缘关系设计了具有较高特异性的简并引物,通过使用RT-PCR和RACE技术,最终获得了麻疯树脂酶基因的全长序列并成功地在大肠杆菌中表达,酶活测定结果表明,麻疯树脂酶在大肠杆菌中表达在包涵体中,但是能产生具有活力的蛋白质,酶活约为0.8U.mL-1。结构预测和比较表明,JcLIP蛋白质具有脂酶的结构核心和催化活性中心,而在非核心区具有较毛霉脂酶更多的插入和随机卷曲,这可能是决定二者之间酶活差异的重要原因。     

原核生物Rubisco的研究进展

1 ,5 二磷酸核酮糖羧化酶 /加氧酶 (Rubisco)是卡尔文循环中的关键酶 ,该酶广泛存在于植物和一些原核生物中。由于在结构上 ,原核生物中Rubisco与植物有相似之处 ,因此人们对原核生物中的Rubisco进行了大量研究 ,就原核生物Rubisco的结构、基因调节、装配等方面的最新进展作一综述。     

作物籽粒淀粉结构的形成与相关酶关系的研究进展

本文综述了前人关于作物籽粒淀粉结构形成以及相关酶的分子生物学研究进展,分析讨论了淀粉结构的形成与酶活性之间的关系,酶对淀粉结构形成的调控机理,为进一步开展作物籽粒淀粉品质改良研究提供理论依据。     

植物过氧化物酶超家族的分子结构

过氧化物酶广泛存在于生物中。基于序列相似性比较,可将真菌、细菌和植物来源的过氧化物酶归为一个超家族－植物过氧化物酶超家族。作者对近几年来植物过氧化物酶超家族的分子结构与功能研究进展,从过氧化物酶的辅基（血红素）微循环结构、过氧化物酶超家族的序列结构域,以及酶分子中底物结合位点和Ca^2＋结合位点的结构等方面作了简要评述。