利用FLP/frt重组系统产生无选择标记的转基因烟草植株

在植物转基因植株产生过程中,对转化细胞进行抗性筛选是通用程序,转化细胞的抗性一般是抗生素抗性或除草剂抗性,将赋予转化细胞抗性的选择标记基因删除是提高转基因植物生物安全性的重要措施。来自于啤酒酵母的FLP/frt位点特异性重组系统可有效删除同向定点重组位点frt之间的基因。通过多步骤重组,建立了可在植物中广泛应用的FLP/frt位点特异性重组系统。该系统包括含有frt位点的植物表达载体pCAMBIA1300-betA-frt-als-frt和含有由热诱导启动子hsp启动的FLP重组酶基因的植物表达载体pCAMBIA1300-hsp-FLP-hpt。利用二次转化的方式将二者先后转入烟草植株,热激处理后,热诱导型启动子hsp调控的重组酶FLP基因的表达催化位于选择标记基因als两侧同向frt位点间的重组反应,有效地删除了选择标记基因als。41%的经热激处理的二次转化植株发生了选择标记基因的删除,表明该系统在获得无选择标记基因的转基因植株中有很好的应用价值。     

安全标记基因在转基因植物中的应用

转基因植物的抗性标记一直是转基因生物安全性争论的焦点,是限制转基因植物应用的瓶颈之一。筛选安全标记基因替代抗生素标记基因已成为解决转基因植物安全性和促进转基因植物应用的重要策略。综述了生物安全标记基因的产生背景、系统分类、筛选原理及不同起源的标记基因在植物基因工程中的应用和存在问题。选用植物内源标记基因已成为转基因植物安全标记基因研究的重要方向。     

无标记（Marker—Free）：转基因植物研究的新趋势

目前 ,几乎所有的植物遗传转化中都要使用选择性标记基因诸如抗生素或除草剂抗性基因等来筛选转化子。为了消除由此而引起的公众的安全性顾虑 ,一种全新的发展策略即获取无选择标记的转基因植物应运而生。无选择标记的转基因植物具有许多独特的优势 ,如消除大众对转基因植物中含有选择标记基因而引起的恐惧及可以反复地向已转化的植物中叠加外源基因等 ,因此 ,这种新策略 (无标记 )有着巨大的应用潜力。本文对获得无标记转基因植物的一些途径做一综述。     

无标记(Marker-Free):转基因植物研究的新趋势

目前,几乎所有的植物遗传转化中都要使用选择性标记基因诸如抗生素或除草剂抗性基因等来筛选转化子.为了消除由此而引起的公众的安全性顾虑,一种全新的发展策略即获取无选择标记的转基因植物应运而生.无选择标记的转基因植物具有许多独特的优势,如消除大众对转基因植物中含有选择标记基因而引起的恐惧及可以反复地向已转化的植物中叠加外源基因等,因此,这种新策略(无标记)有着巨大的应用潜力.本文对获得无标记转基因植物的一些途径做一综述.     

无筛选标记转基因作物的研究进展

目前,大部分植物遗传转化都要使用选择标记基因,诸如抗生素、除草剂等来筛选转化子,由此而引起的转基因生物安全性问题受到了人们的关注。为了消除转基因作物中的筛选标记,一种全新的策略即无选择标记的转基因技术迅速发展起来。该技术既能够减轻大众对转基因植物中含有选择标记基因而引起的恐惧,又能将多个基因逐个整合到同一作物以实现基因聚合。因此这种新策略有着巨大的应用价值。对获得无筛选标记转基因作物的一些方法及其最新研究进展进行综述。     

多选择标记植物表达载体的构建

具有多选择标记的植物基因表达载体有利于转基因植物研究中的转基因植株的筛选.本研究对植物基因表达载体pCAMBIA1301进行了改造,产生了1个具有可溶性的红移绿色荧光蛋白基因(smRS-GFP)、抗除草剂Basta、葡萄糖苷酸酶(GUS)及潮霉素(Hpt)的多选择标记的新的植物基因表达载体.运用这一表达载体的多选择标记可以有效降低检测和筛选转化植株时的假阳性率.此外,如此的基因表达载体也能满足实验室的不同筛选方法的需求.     

利用双T-DNA载体系统培育无选择标记转基因烟草

建立了一种利用双T-DNA载体培育无选择标记转基因植物的方法.通过体外重组构建了双T-DNA双元载体pDLBRBbarm.载体中,选择标记nptⅡ基因和另一代表外源基因的bar基因分别位于2个独立的T-DNA.利用农杆菌介导转化烟草(Nicotiana tabacum L.),在获得的转化植株中,同时整合有nptⅡ基因和bar基因的频率为59.2%.对4个同时整合有nptⅡ和bar基因植株自交获得的T1代株系进行检测分析,发现在3个T1代株系2个T-DNA可以发生分离,其中约19.5%的转基因T1代植株中只存在bar基因而不带选择标记nptⅡ.这一结果说明双T-DNA载体系统能有效地用于培育无选择标记的转基因植物.研究还利用位于2个不同载体上的nptⅡ基因与 bar基因通过农杆菌介导共转化烟草,获得共转化植株的频率为20.0%～47.4%,低于使用双T-DNA转化的共转化频率.     

代谢关键酶基因作为转基因植物选择标记的研究进展

在植物基因工程中,需要用到选择标记基因以便筛选转化子。随着转基因植物的商品化,人们越来越关注其安全性问题,其中主要涉及选择标记的安全性。为了提高转基因植物的安全性,生物学家们开始寻找生物安全的选择标记。本文分别从糖代谢、氨基酸代谢、激素代谢、核苷酸代谢、蛋白质代谢等方面综述了当前以代谢关键酶基因作为转基因植物选择标记的研究进展,此类选择标记为解决转基因植物的安全性问题提供了一条有效途径。     

通过构建三段T-DNA载体高频率获得无标记转基因大豆植株的研究

高频率获得无选择标记转基因植株有利于转基因植物的环境释放和安全性生产,农杆菌介导的共转化法是获得无标记转基因植株的方法之一。含二段T-DNA载体的共转化法已被人们成功应用,而二段以上T-DNA载体的共转化法还未见报道。基于这一目的,通过几个中间质粒构建了含有三段T-DNA的双元表达载体pNB35SVIP1,其中包含1个拷贝bar基因选择标记基因表达盒和2个拷贝VIP1目的基因表达盒。利用EHA101农杆菌菌系介导法转化大豆子叶节,经过在含3~5mg/Lglufosinate培养基上多次筛选,获得了一定数量抗性再生植株,然后对抗性再生植株进行叶片涂抹除草剂、Southernblot和Northernblot检测,共鉴定出51棵T0代转基因植株,转化频率0·83%~3·16%,二个基因的共转化频率为86·4%。在对T1代群体进行叶片涂抹除草剂检测的基础上,不抗除草剂植株进行PCR、Southernblot和Northernblot检测,共鉴定出41棵无选择标记转基因植株,无标记植株获得率为7·6%。检测结果还表明,T1代群体中22·7%的株系发生了基因丢失现象,27·3%的株系发生了bar基因沉默现象,目的基因在37·1%的无标记植株中发生了沉默现象。三段T-DNA的双元表达载体是获得无标记转基因植株的理想途径。     

利用Ac/Ds转座子系统在水稻中获得无选择标记转基因植株的方法

获得无选择标记转基因植株是进行重复转基因及消除转基因植株中标记基因潜在危害性的关键。实验采用了Ac／Ds转座子系统在水稻(Oryza sativa,L．)中进行无hpt选择标记的转基因。将含有目的基因bar的Ds元件和hpt标记基因置于同一个T-DNA中,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHAl05介导将Ac-T-DNA及Ds-T-DNA分别转入到不同的水稻植株,再将单拷贝的Ac-T-DNA植株与单拷贝的Ds-T-DNA植株杂交得到同时含有Ac和Ds元件的F1植株,Fl自交产生F2后代,F2植株中转座后的Ds元件与T-DNA独立分离,在总共100株F2水稻植株中筛选得到2株只含有Ds元件插入而无hpt标记基因的转基因水稻植株。结果表明,利用Ac／Ds转座子系统在水稻中获得无选择标记的转基因植株是可行的。