异源四倍体鲫鲤雌核发育后代及其亲本RAPD分析

异源四倍体鲫鲤是湖南师范大学鱼类发育生物学实验室和湖南湘阴县东湖渔场在红鲫(♀)和湘江野鲤(♂)的杂交后代中选育出来的四倍体鱼,目前已连续繁殖14代(F3-F16),已形成一个四倍体性能代代相传、遗传性状稳定的四倍体鱼群体,这是世界上唯一人工培育的两性可育的异源四倍体鱼[1—2]。利用四倍体鱼与二倍体白鲫、二倍体鲤鱼杂交,可获得生长快、肉质鲜美、抗病力强等优良性状的不育三倍体湘云鲫、三倍体湘云鲤[3],并已在全国28个省市推广养殖,取得了显著的经济和社会效益。异源四倍体鲫鲤雌性个体产生的二倍体卵子具有两套染色体,在没有染色…     

6-DMAP抑制栉孔扇贝（♀）×虾夷扇贝（♂）受精卵第一极体释放后染色体的分离状况

三倍体贝类因其具有生长快、个体大、肉质佳和成活率高等优良的经济性状而存水产养殖业中具有重要的应用价值。获得100％三倍体贝类的最佳途径是通过四倍体贝类与二倍体贝类杂交来获得。目前已经发展出多种诱导四倍体的方法,包括抑制受精卵第一极体的释放、抑制受精卯的卵裂、细胞融合和利用人工雌核发育等方法。人工诱导四倍体技术已经在多种鱼类上获得成功。     

白鲫（♀）×红鲫（♂）异源四倍体鱼的倍性操作及其生殖力的研究

采用热休克调控技术诱导出103尾第一代白鲫（♀）×红鲫（）异源四倍体鱼,并对其生殖力进行了研究。1或2龄的四倍体雄鱼能产生精子,而雌鱼不能产生正常的卵。将异源四倍体雄鱼与二倍体白鲫雌鱼交配产生倍间三倍体鱼,染色体检查证明是整三倍体（3N＝150）,但其受精率很低（11．4—51．3％,平均32．4％）．网箱养殖结果表明,倍间三倍体白鲫的生长速度比白鲫快30％以上,雌雄均不育．并用冷休克处理回收异源四倍体4N（）×白鲫2N（♀）受精卵的第二极体产生了新的四倍体鱼．文中还对第一代异源四倍体鱼的批量生产、生殖能力以及异源三倍体鱼的生产应用进行了讨论．     

离体培养柑桔小胚获得三倍体植株

三倍体植株因不能进行正常的减数分裂,常产生败育的胚囊和花粉;又因柑桔属植物具有单性结实的能力,因而人工培育三倍体植株已成为获得无核柑桔品种的一条重要途径。在柑桔属植物中,获得三倍体主要有三条途径:(1)通过胚乳离休培养诱导三倍体植株;(2)四倍体品种同二倍体品种杂交,获得三倍体;     

鱼类人工多倍体育种的研究进展

鱼类多倍体育种是鱼类育种最热的领域之一。本文概述了鱼类人工多倍体育种研究的进展情况,包括鱼类人工多倍体育种的方法和人工多倍体鱼类可育性等方面。鱼类人工多倍体育种的方法主要有物理、化学和生物学方法,三倍体鱼预期是不育的,四倍体是可育的,但目前两性可育的四倍体的报道还很少。本文还对人工多倍体鱼的生物学意义作了简单的阐述。本文旨在为对今后进一步开展鱼类人工多倍体育种研究提供参考。     

二倍体鲫鲤F2产生不同倍性卵子的证据

在检测到鲫鲤F2产生3种不同大小(直径分别为0.13 cm,0.17cm和0.2 cm)类型的卵子基础上,进行了F2(♀)×红鲫(♂)及F2(♀)×四倍体鲫鲤(♂)的交配实验.通过染色体计数和流式细胞仪分析,在F2(♀)×红鲫(♂)后代中获得了四倍体、三倍体、二倍体鱼;在F2(♀)×四倍体鲫鲤(♂)后代中获得了四倍体和三倍体鱼.这两个交配组合后代中出现的不同倍性的鱼类为证明鲫鲤F2能产生三倍体、二倍体和单倍体卵子提供了进一步证据.F2(♀)×红鲫(♂)中雄性四倍体鱼的存在说明在四倍体后代中存在基因型为XXXY的个体.对上述两个交配组合后代的四倍体鱼和三倍体鱼的性腺结构观察表明四倍体鱼是可育的,而三倍体鱼是不育的.作者认为鲫鲤F2能够产生二倍体和三倍体卵子与核内复制机制和生殖细胞的融合有关.     

九孔鲍四倍体诱导的研究

采用二倍体鲍卵子,抑制其第一极体、抑制其第一极体和第二极体诱导四倍体,用三倍体鲍卵子与普通鲍精子受精并抑制其第一极体,以及用三倍体鲍的其它方法诱导四倍体。用倍体分析仪检测DNA相对含量以判别其倍性。实验结果,先后共培育出存活的四倍体鲍239个,个体大小为2.5～6.0cm;挑选性腺发育较好的四倍体鲍(包括雌雄),与普通鲍杂交繁育三倍体,先后共培育出10批次,培育出的苗量共计15.8万个。     

6-DMAP抑制栉孔扇贝（♀）×虾夷扇贝（♂）受精卵第一极体释放后染色体的分离状况

三倍体贝类因其具有生长快、个体大、肉质佳和成活率高等优良的经济性状而在水产养殖业中具有重要的应用价值[1].获得100%三倍体贝类的最佳途径是通过四倍体贝类与二倍体贝类杂交来获得.目前已经发展出多种诱导四倍体的方法,包括抑制受精卵第一极体的释放、抑制受精卵的卵裂、细胞融合和利用人工雌核发育等方法.人工诱导四倍体技术已经在多种鱼类上获得成功[2].迄今,国内外学者已对多种贝类[3]进行了四倍体育种研究,都获得了一定比例的四倍体胚胎或幼虫,甚至是稚贝,但是除了太平洋牡蛎Crassostrea gigas(Thunberg)[4]外大部分由于存活率低最后都没有获得两性能育且形成群体的四倍体贝类.     

鱼类的三倍体育种

三倍体不育的特点使三倍体鱼的人工诱导成为水产养殖业关注的研究领域之一。近年来,一些研究成果已开始在养殖生产中应用。本文概要地介绍了鱼类三倍体诱导的意义、原理、方法以及研究现状和前景。     

人工诱导异源四倍体和倍间三倍体白鲫的红细胞观察及其相对DNA含量测定

染色体核型分析表明,异源四倍体白鲫含有两套白鲫染色体和两套红鲫染色体,新四倍体白鲫含有三套白鲫染色体和一套红鲫染色体,倍间三倍体白鲫含有二套白鲫染色体和一套红鲫染色体。为进一步阐明人工诱导多倍体的染色体倍性与细胞和细胞核及其相对DNA含量之间的相关关系,作者测量了异源四倍体、新四倍体和借间三倍体鱼红细胞及其核的大小,同时测定了它们的红细胞相对DNA含量,并与它们亲本红细胞及其精子细胞相对DNA含量进行了比较。       

离体培养柑桔小胚获得三倍体植株

兰倍休植株因不能进行正常的减数分裂, 常产生败育的胚囊和花粉;又因柑桔属植物具 有单性结实的能力,因而人工培育三倍体植株 已成为获得无核柑桔品种的一条重要途径。在 柑桔属植物中,获得三倍体主要有三条途径： (1)通过胚乳离体培养诱导三倍体植株［[I>; (2) 四倍体品种同二倍体品种杂交,获得三倍体[41 . (3）单胚的二倍体柑桔品种作母本进行杂交或 自然授粉后,可产生一定比例的,重量为正常种 子1/6至123的小粒种子,并已确定此小粒种 子是三倍体［[2,3,8,10]。这无疑为柑桔的三倍体培育 提供了一条简便、实用和快速的新途径。     

从ATPase8-6基因研究杂交多倍体鱼线粒体母性遗传

异源四倍体鲫鲤是世界上首例人工培育的两性可育并形成群体的且能自然繁殖的四倍体鱼。本文采用质粒克隆测序法测定了红鲫、异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和三倍体湘云鲤的ATPase8和ATPase6基因全序列 ,结合鲤鱼、日本白鲫和斑马鱼的同源序列 ,对不同倍性水平鲤科鱼类的ATPase8和ATPase6基因进行了比较 ,分析了碱基组成、变异情况以及核苷酸和氨基酸序列差异。红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤、日本白鲫、三倍体湘云鲫和三倍体湘云鲤之间的序列差异为 0 0 % - 1 3 4 % ,它们与外群斑马鱼之间的序列差异为 2 7 9% -31 0 %。用MEGA软件中的MP法、ME法、NJ法和UPGMA法构建分子系统树 ,得到了相似的拓扑结构。结果分析表明 ,人工杂交多倍体异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和三倍体湘云鲤在线粒体ATPase8和ATPase6基因上具有严格的母性遗传特征。值得注意的是 ,异源四倍体鲫鲤经过 1 1代的繁育后 ,与其原始母本红鲫仍然保持了非常高的同源性 ,说明了新的异源四倍体基因库在线粒体ATPase8和ATPase6基因上拥有稳定的遗传特性。对不同倍性鲤科鱼类线粒体ATPase8和ATPase6基因的研究表明 ,ATPase8和ATPase6基因是杂交鱼后代遗传变异研究的一个很好的分子标记     

橡胶树四倍体来源鉴定及不同倍性叶片解剖结构比较

利用25对SSR引物,采用基于PCR的毛细管电泳法鉴定14株人工诱导四倍体的来源,并采用2种切片方法比较橡胶树不同倍性叶片的厚度差异。结果表明,14株四倍体中9株为同一无性系,另有5株为同一无性系或全同胞子代,14株四倍体的同源二倍体的亲本之一为热研73397。橡胶树二、三、四倍体间的叶片、上表皮、栅栏组织、海绵组织的厚度差异极显著(P0.01),且随着倍性的增加而增加。二、三、四倍体鲜叶厚度分别为159.98±16.04μm、188.52±16.29μm、204.21±16.45μm,叶片石蜡切片厚度分别为139.94±13.22μm、169.53±15.07μm、180.84±26.71μm。以鲜叶厚度177.81μm或石蜡切片厚度160.70μm为临界值可以区分人工体细胞诱导四倍体橡胶树获得的二、四倍混合群体中的二倍体和四倍体。不同倍性的叶片结构紧密度和栅海比大小排序均为:三倍体四倍体二倍体,叶片结构疏松度大小排序为:二倍体四倍体三倍体。本研究结果为橡胶树多倍体资源的鉴定和多倍体育种策略选择提供了参考。     

异源四倍体鲫鲤雌雄差异的RAPD标记

异源四倍体鲫鲤是从红鲫和湘江野鲤的杂交后代选育出来的,已经形成了一个遗传性状稳定的四倍体鱼新种群。用异源四倍体鲫鲤(雄性)和二倍体白鲫(雌性)生产的三倍体湘云鲫已经在全国推广应用。因此,如果能够了解异源四倍体鲫鲤的性别分化机制,人为地控制异源四倍体鲫鲤的性别分化,生产出大量的超雄鱼,这对于三倍体湘云鲫的产业化生产有重要的意义。刘少军等对异源四倍体鲫鲤的染色体组型进行了分析,并没有发现异源四倍体鲫鲤有明显的特化的性染色体,这说明通过细胞遗传学研究异源四倍体鲫鲤的性别遗传机制是有困难的。       

中华绒螯蟹多倍体的诱导研究 : Ⅱ.热休克诱导中华绒螯蟹三倍体胚胎和四倍体 状幼体

采用热休克方法对中华绒螯蟹进行了三倍体、四倍体的人工诱导研究。结果表明,在卵子受精后（发育水温２０±１℃）１０～２５分钟,用３８～４１℃的高温处理１～２分钟,三倍体的平均诱导率为１０％～５０％,而对受精后３０分钟的卵子进行诱导,或在４０℃下处理超过２５分钟和处理温度高于４２℃诱导１５分钟的各试验组,均未检测到有三倍体胚胎。依据诱导三倍体的适宜诱导温度和处理时间,将受精后８１／２～９５／６小时的卵子用４０℃热休克处理１５分钟,均获得了一定比例的四倍体胚胎,其中四倍体最高诱导率为５２９６％。检查卵受精后８５／６小时经热休克处理所孵得的氵蚤状幼体,其四倍体的出现频率约为１９７％。讨论了热休克处理促使第一极体保留生产三倍体和抑制第一次卵裂诱导四倍体的条件和技术关键,以及诱导参数与胚胎发育、胚胎存活的相互关系等问题。     

三倍体白鲫的生物学特性

由人工诱导的异源四倍体白鲫雄鱼与正常的二倍体白鲫雌鱼交配获得的异源三倍体白鲫,其主要生物学特性同二倍体白鲫进行比较研究表明,三倍体白鲫具有体形较大、相对体高和相对尾柄高较高、侧线上下鳞数目较多的形态特征,仍保留着二倍体白鲫以浮游植物为主的植食性营养方式,雌雄均不育,比二倍体生长快,网箱养殖１１２天后,体重比二倍体平均增加３２．３８％。试验证实三倍体白鲫是一个具有养殖生产前景的新对象。     

不同倍性鲫鲤鱼Dmc1基因cDNA的克隆 及其表达分析

酵母菌 Dmc1(disrupted meiotic cDNA)基因是一个在减数分裂前期Ⅰ表达的特异基因, 其产物是减数分裂同源染色体配对所必需的. 根据酵母菌、小鼠以及人的DMC1中保守氨基酸序列合成简并引物, 分别克隆了二倍体红鲫(Carassius auratus red var.)、湘江野鲤(Cyprinus carpio L.)、日本白鲫(Carassius cuvieri)、三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤Dmc1基因部分cDNA序列. 通过cDNA末端快速分离法(RACE)进一步获得了以上5种鱼Dmc1的cDNA全长, 其中红鲫Dmc1、湘江野鲤Dmc1和日本白鲫Dmc1全长均为1375 bp, 三倍体湘云鲫Dmc1全长1383 bp, 异源四倍体鲫鲤Dmc1全长1379 bp, 这5种鱼各自都编码342个氨基酸. 结果表明, 红鲫、湘江野鲤和日本白鲫的DMC1蛋白的氨基酸同源性高达97.3%, 说明DMC1蛋白在这3种鱼里具有高度保守性; 而三者与已知序列的人、小鼠和斑马鱼(Danio rerio)DMC1蛋白的氨基酸同源性分别为 86%, 86%和95%. 以分离得到的不同倍性鱼Dmc1基因编码区中完全相同的序列设计特异引物进行表达分析. RT-PCR结果表明, Dmc1只在性腺中表达, 在其他组织中不表达; 通过实时荧光定量PCR(real-time PCR), 对Dmc1基因在繁殖季节的二倍体红鲫, 三倍体湘云鲫, 四倍体鲫鲤性腺中的表达进行分析, 发现Dmc1在不同倍性鱼的性腺表达有差异, 在卵巢和精巢均表现为: 三倍体表达最高, 二倍体次之, 四倍体的表达最弱, 特别是在三倍体卵巢的表达远高于在二倍体和四倍体的表达. 同时, 对这3种鱼的性腺进行组织切片分析, 发现二倍体和四倍体鱼的性腺发育良好, 且四倍体成熟度高于二倍体, 而三倍体鱼性腺发育缓慢未达到性成熟, 特别是卵巢的发育相当不好. 由此可见, 在不同倍性鲫鲤鱼中Dmc1基因也是减数分裂特异的基因, 其表达与倍性无显著的相关性, 而与性成熟相关; 并且在三倍体卵巢中的过量表达可能与其减数分裂异常及其不育有关.     

不同倍性鲫鲤鱼Dmc1基因cDNA的克隆 及其表达分析

酵母菌 Dmc1(disrupted meiotic cDNA)基因是一个在减数分裂前期Ⅰ表达的特异基因, 其产物是减数分裂同源染色体配对所必需的. 根据酵母菌、小鼠以及人的DMC1中保守氨基酸序列合成简并引物, 分别克隆了二倍体红鲫(Carassius auratus red var.)、湘江野鲤(Cyprinus carpio L.)、日本白鲫(Carassius cuvieri)、三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤Dmc1基因部分cDNA序列. 通过cDNA末端快速分离法(RACE)进一步获得了以上5种鱼Dmc1的cDNA全长, 其中红鲫Dmc1、湘江野鲤Dmc1和日本白鲫Dmc1全长均为1375 bp, 三倍体湘云鲫Dmc1全长1383 bp, 异源四倍体鲫鲤Dmc1全长1379 bp, 这5种鱼各自都编码342个氨基酸. 结果表明, 红鲫、湘江野鲤和日本白鲫的DMC1蛋白的氨基酸同源性高达97.3%, 说明DMC1蛋白在这3种鱼里具有高度保守性; 而三者与已知序列的人、小鼠和斑马鱼(Danio rerio)DMC1蛋白的氨基酸同源性分别为 86%, 86%和95%. 以分离得到的不同倍性鱼Dmc1基因编码区中完全相同的序列设计特异引物进行表达分析. RT-PCR结果表明, Dmc1只在性腺中表达, 在其他组织中不表达; 通过实时荧光定量PCR(real-time PCR), 对Dmc1基因在繁殖季节的二倍体红鲫, 三倍体湘云鲫, 四倍体鲫鲤性腺中的表达进行分析, 发现Dmc1在不同倍性鱼的性腺表达有差异, 在卵巢和精巢均表现为: 三倍体表达最高, 二倍体次之, 四倍体的表达最弱, 特别是在三倍体卵巢的表达远高于在二倍体和四倍体的表达. 同时, 对这3种鱼的性腺进行组织切片分析, 发现二倍体和四倍体鱼的性腺发育良好, 且四倍体成熟度高于二倍体, 而三倍体鱼性腺发育缓慢未达到性成熟, 特别是卵巢的发育相当不好. 由此可见, 在不同倍性鲫鲤鱼中Dmc1基因也是减数分裂特异的基因, 其表达与倍性无显著的相关性, 而与性成熟相关; 并且在三倍体卵巢中的过量表达可能与其减数分裂异常及其不育有关.     

不同倍性鱼垂体细胞和超微结构比较

对繁殖季节和繁殖季节后的二倍体红鲫(Carassius auratus red var.)、三倍体湘云鲫以及四倍体鲫鲤脑垂体细胞的显微和超微结构以及组织化学特性进行了比较研究. 结果表明, 3种鱼脑垂体中都存在6种不同类型分泌细胞, 但是不同倍性鱼的垂体细胞大小存在明显差异, 就同一类细胞体积而言, 四倍体鱼垂体细胞大于三倍体垂体细胞, 三倍体垂体细胞大于二倍体垂体细胞. 在繁殖季节, 四倍体鲫鲤中腺垂体的GTH细胞所占比例最大, 其次是二倍体红鲫, 最少的是三倍体湘云鲫, 该现象与四倍体鲫鲤的性腺发育提前、三倍体湘云鲫不育有关联; 另一方面, 三倍体湘云鲫中腺垂体中STH细胞所占比例最高, 其次是二倍体, 最少的是四倍体鲫鲤, 这与三倍体湘云鲫生长速度最快、四倍体鲫鲤生长速度相对缓慢有关. 另外, 三倍体湘云鲫中腺垂体GTH细胞中的分泌颗粒和分泌小球在繁殖季节没有大量排出, 而四倍体鲫鲤和二倍体红鲫明显有大量排出, 说明三倍体湘云鲫的不育性与GTH中的激素不排出有关. 以上结果说明, 不同倍性鱼类在垂体结构方面表现出的差异与它们的生长速度、性腺发育等方面具有关联性.     

长牡蛎“海大2号”四倍体的人工诱导

为筛选适宜的四倍体诱导条件, 研究了细胞松弛素B(CB)浓度(0.3、0.5、0.7和0.9 mg/L)、起始诱导时间(5、10和15min)、诱导持续时间(10、15、20和25min)及三者的交互作用对长牡蛎“海大2号”四倍体诱导率(四倍体率)和D形幼虫率的影响, 并对诱导处理组获得的幼贝倍性进行检测分析, 进一步验证了研究诱导方法获得可存活长牡蛎“海大2号”四倍体幼贝的可行性。结果表明, CB浓度和起始诱导时间对长牡蛎“海大2号”四倍体率有显著影响(P<0.05), 而诱导持续时间对四倍体率影响不显著(P>0.05), 但是三者的交互作用对四倍体率有显著影响(P<0.05)。在CB浓度为0.5 mg/L、起始诱导时间为15min及诱导持续时间为20min时, 四倍体率有最大值为37.82%。CB浓度、起始诱导时间和诱导持续时间均对D形幼虫率有显著影响(P<0.05), 但是三者的交互作用对D形幼虫率没有显著影响(P>0.05)。增加CB浓度或延长诱导持续时间, D形幼虫率均呈降低的趋势; 起始诱导时间为5min时, D形幼虫率显著高于其他起始诱导时间。获得幼贝的两个诱导处理组的倍性检测结果显示, 长牡蛎“海大2号”四倍体率分别为2.22%和3.03 %, 与幼虫期相比四倍体率显著下降。通过对CB浓度、起始诱导时间及诱导持续时间进行优化, 可以筛选出适宜的长牡蛎“海大2号”四倍体诱导条件。研究结果为长牡蛎“海大2号”四倍体培育提供了重要的参考资料。