宏基因组学在未培养微生物研究中的应用

自然环境中约99%的微生物不能用传统的分离培养方法获得其纯培养。随着宏基因组技术的出现,人们可以对这一庞大的未知世界进行多方面的研究,包括微生物的生理、生态及其基因功能等。利用这一技术,研究者已经对地球上的许多生境进行了研究,并取得了很多新的成就。简要概述这一技术在研究未培养微生物方面的应用。     

微生物可培养性低的生态学释因与对策

纯培养技术一直是微生物学研究的基石,但其单一的营养结构和生境与自然环境中微生物多样性、协同代谢等明显矛盾,从而成为部分微生物难以复苏的主要障碍。细菌共同协作的自然生存方式的崩溃、生境的极度营养变化和生态位巨变等是微生物可培养性低的主要生态学原因。非培养技术、加富培养、混合培养、稀释培养、模拟自然培养和综合方法等是主要的研究手段和策略,可在不同程度上解决微生物可培养性低的缺陷和问题。     

宏基因组技术在开发极端环境未培养微生物中的应用

人类对自然环境中约99％的微生物不能用传统的方法进行纯培养,对于极端环境中的微生物更是知之甚少.随着宏基因组技术的出现,人们可对选一庞大的未知世界进行多方面研究.目前研究者利用这一技术已经对地球上的多种极端生境进行了研究,并取得了很多新的成就.简要概述这一技术在极端环境未培养微生物研究中的应用.     

昆虫肠道微生物分离培养策略及研究进展

昆虫肠道作为一种特殊生境,生存着多种多样的共生微生物,并且肠道内的很多微生物与自然界其他生境的微生物种类显著不同。基于对纯培养微生物的研究,科学家们发现,肠道微生物与昆虫营养、生长发育及免疫等功能密切相关。因此,分离培养是发现微生物新种类、新基因和新功能的基础。然而,自然界可培养的微生物大约只占总数的1%。为了能够对更多的微生物进行分离和培养,近二十年来,微生物学家们发展了诸多新的培养技术和策略并利用它们从昆虫肠道分离出了很多新的难培养微生物。这些新的微生物种类极大地丰富了我们对肠道共生微生物生理作用与功能的认识。以此为基础,本文综述了昆虫肠道微生物分离培养的策略及研究进展,并对未来该领域的发展进行了展望。     

基于整合宏组学技术认识腐生生境功能微生物区系

微生物区系在天然生境中分布广泛,利用传统纯培养等方法无法全面认识其分布和功能,因此被认为是地球上的"暗物质"。随着新一代测序技术与高分辨率质谱技术的快速发展,研究者可以在非培养条件下全面快速分析天然生境中微生物组及其动态变化,这开启了微生物组时代,使得研究地球上"暗物质"成为可能,从而改变了微生物学研究的现状。腐生生境作为生物地球化学循环的重要推动部分,因其高效降解转化有机废弃物能力而被广泛关注。腐生生境由于原料多变、环境复杂等原因未能被全面深入研究,而整合宏组学技术则为解析相关生境微生物区系的多样性及其功能动态演替规律奠定了技术基础。基于整合宏组学数据分析与环境参数的优化,可以在认识微生物组及其功能的动态水平上,针对复杂物料建立高效降解转化的绿色转化工艺,促进农牧业废弃物无害化和资源化利用进程。     

中国微生物物种多样性研究进展

微生物是分布最为广泛的生命形式,几乎分布到地球上的所有生境,具有丰富的物种多样性。我国地域辽阔,跨越热带至寒温带,气候条件多样,地理环境与生态系统类型复杂,是世界上生物多样性最丰富的国家之一。我国已开展了大量微生物多样性研究,并证实我国多样的生境蕴藏着丰富的微生物物种多样性。目前我国已报道真核微生物(菌物)约14,700种,其中包括真菌约14,060种、卵菌约300种、黏菌约340种,而真菌中有药用菌473种、食用菌966个分类单元。特别是近年来通过免培养的分子生物学技术发现我国存在丰富的原核微生物多样性。本文概述了传统方法和现代分子生物学技术在我国原核微生物(古菌、细菌)和真核微生物(真菌、卵菌、黏菌)物种多样性研究的最新进展。     

连续流生物反应器技术在微生物培养中的应用

自然环境中99%微生物在实验室条件下仍是不能被培养的,称之为"未培养"微生物或微生物"暗物质"。对其进行研究不仅有助于认识环境中微生物代谢多样性,丰富生命之树,同时未培养微生物还蕴含着巨大的新基因和新天然产物资源。但传统培养技术的局限性阻碍了"未培养"微生物资源的开发和利用。虽然随着分子生物学技术的发展,可以直接从环境中获得未培养微生物的遗传信息,分析微生物的广泛代谢多样性,但微生物的生理特征和代谢产物等分析仍然需要建立在研究纯菌株的基础上。目前,已经有很多新颖的培养技术被研发,如原位培养技术、共培养技术和连续流生物反应器培养技术等用于挖掘未培养微生物资源。本文主要介绍了连续流生物反应器培养新技术的发展与改进,探讨了"未培养"微生物培养技术及设备的发展方向,以进一步促进"未培养"微生物资源的开发与利用。     

土壤样品中细菌多样性的分析

微生物分子生态学的研究表明,自然界中只有很小部分的微生物得到了纯培养,绝大多数微生物是未被开发的和未知的,因此探索和培养那些未知的微生物物种可以发掘微生物新的菌种资源[1-2]。     

未培养微生物的研究与微生物分子生态学的发展*

近年来现代分子技术和基因组学逐渐渗透到有关生命科学的整个领域,也为微生物生态学提供了新的研究方法和机遇。16S rRNA基因序列分析、DNA-DNA杂交、核酸指纹图谱以及宏基因组学等分子技术检查自然环境中的微生物,可以克服传统纯培养技术的不足,是一条探知未培养微生物、寻找新基因及其产物的新途径,开启了我们认识微生物多样性和获得新资源的大门。     

环境微生物不依赖于培养的基因组学研究及应用

微生物在生物圈中分布广泛,并且在地球物质循环中占有重要地位,但是约99﹪的微生物目前还不能通过传统的培养方法得到纯培养物（即未培养微生物）,给这些未培养微生物的研究带来很大的困难。随着分子生物学的快速发展及其在微生物研究中的广泛运用,促进了以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科--环境基因组学的产生和发展。在不进行相关微生物培养分离的情况下,通过从环境样品中直接提取获得所有微小生物的全部遗传物质,并构建环境基因组文库;进一步利用功能基因组学研究策略,从文库中寻找编码产生新的有生物活性产物的基因;通过对系统发育相关锚定位点基因序列分析,从而确定特定生态环境体系中未培养微生物的种类结构组成及进化地位,并最终重建该体系中微生物群体的基本物质循环模式。此外,环境基因组学也可以在对未培养微生物生理生化特性深入了解的基础上,建立发展合适的培养体系,最终获得某些特定微生物的纯培养物。本文对环境基因组的构建及相关分析研究策略的进展进行了综述;同时介绍了其在微生物分类及生态学研究的应用。     

从环境中分离培养微生物:培养基营养水平至关重要

根据目前的微生物学知识体系,利用现有的微生物培养技术仅仅能够分离和培养部分微生物,自然环境中绝大多数微生物暂不能培养。本文总结归纳了部分微生物培养技术和培养策略,包括采取生境隔离、延长培养时间以及模拟自然环境条件等方法,尤其是培养基的营养水平对可培养微生物数量及种类产生重要影响。简要总结了寡营养微生物及其生态意义,以及营养物浓度影响微生物生长的机理。提出可根据微生物的生态环境条件及细胞生理特性,设计合理的培养条件和培养方法,以及采用多种分离培养方法联合,以期最终提高环境微生物的可培养性。     

宏基因组技术在开拓天然产物新资源中的应用

微生物代谢产物具有巨大的化学多样性,是多种抗生素和其它药物的重要来源。由于现有培养手段的局限性,可培养的微生物不到微生物总数的1％,使绝大部分微生物资源的开发利用受到制约。近年来．直接提取环境样品中混合微生物总基因组DNA,利用可培养的宿主细菌构建宏基因组文库,通过筛选目的克隆,寻找活性代谢产物,取得瞩目进展。对这一新领域的研究进展结合我们的研究概况进行了简要综述。     

Autoradiographic method to screen for soil microorganisms which accumulate zinc

An autoradiographic method was developed to screen for and isolate soil microorganisms which accumulate zinc (Zn). Diluted soil samples (Rubicon fine sand, Entic Haplorthods [pH 5.9]) were plated on soil extract-glucose agar containing radioactive 65Zn. After 7 days of incubation, individual colonies which accumulated sufficient 65Zn could be detected by autoradiography. These colonies were isolated and confirmed as Zn accumulators in pure culture by using the autoradiographic plate technique. Most Zn accumulators were filamentous fungi, identified as Penicillium janthinellum, Aspergillus fumigatus, and Paecilomyces sp. Isolates of Penicillium janthinellum were the most common Zn accumulators. The most abundant Zn-accumulating bacteria were Bacillus spp. The validity of the autoradiographic plate technique to differentiate soil microbes which accumulate Zn was examined independently by energy dispersive X-ray analysis in a scanning electron microscope. This method confirmed that fungal isolates which gave positive autoradiographic responses in the plate assay bioaccumulated more Zn in their biomass than fungal isolates from the same soil sample which gave negative autoradiographic responses. Thus, this technique can be applied to specifically screen for and isolate microbes from the environment which bioaccumulate Zn.     

Autoradiographic method to screen for soil microorganisms which accumulate zinc.

An autoradiographic method was developed to screen for and isolate soil microorganisms which accumulate zinc (Zn). Diluted soil samples (Rubicon fine sand, Entic Haplorthods [pH 5.9]) were plated on soil extract-glucose agar containing radioactive 65Zn. After 7 days of incubation, individual colonies which accumulated sufficient 65Zn could be detected by autoradiography. These colonies were isolated and confirmed as Zn accumulators in pure culture by using the autoradiographic plate technique. Most Zn accumulators were filamentous fungi, identified as Penicillium janthinellum, Aspergillus fumigatus, and Paecilomyces sp. Isolates of Penicillium janthinellum were the most common Zn accumulators. The most abundant Zn-accumulating bacteria were Bacillus spp. The validity of the autoradiographic plate technique to differentiate soil microbes which accumulate Zn was examined independently by energy dispersive X-ray analysis in a scanning electron microscope. This method confirmed that fungal isolates which gave positive autoradiographic responses in the plate assay bioaccumulated more Zn in their biomass than fungal isolates from the same soil sample which gave negative autoradiographic responses. Thus, this technique can be applied to specifically screen for and isolate microbes from the environment which bioaccumulate Zn.     

肠道微生物培养的研究进展及应用

肠道中栖居着组成复杂、功能多样的微生物群,这些微生物群在宿主免疫、营养吸收、代谢调节等方面发挥着重要作用。随着测序技术的快速发展,肠道微生物研究通过16S rRNA基因测序和宏基因组测序产生了大量的数据,其中许多未组装的序列成为微生物“暗物质”。近年来,不少研究利用多种不同微生物分离培养方法,结合高通量鉴定技术,从人、小鼠、猪肠道中分离了大量的微生物,丰富了菌株资源,为解析微生物“暗物质”以及后续肠道微生物功能和应用研究提供了基础和保障。尽管微生物的可培养性受到多种因素的影响,大部分微生物尚处于“未培养”的状态,但无论是病因研究还是生理和遗传特征的解析都离不开微生物实体资源的获取。肠道微生物的分离培养对微生物研究从关联分析向菌群功能验证、因果机制解析和功能菌株开发的深入研究具有重要意义。本文旨在探讨和综述影响微生物可培养性的因素,总结回顾肠道微生物的培养方法并阐述肠道微生物培养研究的进展,以期为肠道微生物培养研究提供新的视角。     

Detection and isolation of radionuclide-accumulating bacteria by autoradiography

A simple and rapid method for the detection and isolation of radionuclide-accumulating microorganisms is described. Water samples are mixed with a radioisotope solution and peptone agar in Petri dishes and incubated at 25 C. After bacterial colonies have appeared the agar is removed from the dish and placed upside down on X-ray film covered with thin plastic foil. Black spots on the developed radiogram reveal which surface colonies contain radionuclide-accumulating bacteria. From these colonies pure cultures are obtained by standard methods. So far, bacterial strains have been isolated accumulating one of the following nuclides: cobalt-60, strontium-89, ruthenium-106, iodine-131, cesium-134, cerium-144.     

Quantitative comparison of rat hepatocyte functions in two improved culture systems with or without rat liver epithelial cell line

We quantitatively evaluated two recently-developed novel techniques for hepatocyte cultivation in a dish level; that is, spheroid culture and membrane-supported collagen (CN) gel sandwich culture, in terms of cellular maintenance, albumin secretion and 7-ethoxycoumarin (7EC) metabolism to 7-hydroxycoumarin (7HC) as a marker for cytochrome P450 IA1 activity in the presence and absence of rat liver epithelial cell line (RLEC) during one month of culture, together with conventional coculture with RLEC in CN-coated dishes as a control. RLEC prevented spheroid loss caused by its detachment from the culture dishes often occurring in pure culture. CN-gel sandwich by itself improved remarkably hepatocyte maintenance when compared with CN-gel free systems, thereby resulting in enhancement of overall functional expressions as compared with CN-gel free systems. RLEC in CN-gel sandwhich, however, reduced cellular sustainment probably due to its suppression of hepatocyte growth. Although there were no significant differences in albumin secretion per cell among the five cultures examined, CN-gel sandwich expressed markedly higher 7EC metabolizing activity per cell, where RLEC presence had a preferable influence. Consequently, membrane-supported CN-gel sandwich was the most superior technique for hepatocyte cultivation from the standpont of both cellular maintenance and its functional expressions per cell.     

提高微生物可培养性的方法和措施

目前自然界中只有极少部分微生物能够得到培养,严重阻碍了对微生物生命活动规律的研究和微生物资源的开发。改进传统培养方法,采用新型培养技术,提高微生物可培养性,大量培养自然界中存在的微生物,从而更全面、准确地了解微生物细胞的生命规律、获悉微生物群落中各种微生物之间的动态相互作用和相互协调的规律,对环境微生物工艺进行准确地设计、精细地调控和高效地利用。简要介绍了微生物不可培养的原因,系统总结了有关提高微生物可培养性方法的最新研究进展,提出研究中存在的问题,并阐述了模拟自然环境条件、强调微生物相互关系是提高微生物可培养性的关键。     

未培养环境微生物培养方法的研究进展

自然界中微生物种类繁多、功能多样、分布广泛,对人类健康安全、生态稳定和物种进化等发挥不可替代的作用。尽管微生物培养技术至今已有一百多年,然而由于各种限制因素的制约,目前成功分离培养的微生物仅占0.1%-1.0%,自然界中仍有十分丰富的微生物资源有待挖掘和开发利用。如何理解难培养微生物的制约因素并探索作用机制,同时借此开发新型微生物培养方法则尤为必要。本文首先分析了典型环境微生物生长的限制因素,然后介绍了目前利用传统培养改进措施进行分离筛选的研究成果,进一步综述了原位培养、共培养、微流控培养技术、细胞分选技术等新型培养技术在难培养微生物分离培养中的应用,最后对目前培养法存在的瓶颈问题进行深入分析,提出今后可在多技术联合使用、难培养微生物复苏机制、微生物互作机制、代谢途径与调控机制等方面进行研究,以期为今后微生物资源开发利用提供借鉴。