鼠伤寒沙门氏菌asd基因的克隆及序列分析

以鼠伤寒沙门氏茵标准株基因组DNA作为模板,用PCR的方法扩增鼠伤寒沙门氏菌的asd基因并克隆入质粒pUCl9,并对其进行测序,序列与献报道一致。同时将质粒pYA248上的链球菌asd基因进行了置换,观察了分别含有链球菌asd基因与鼠伤寒沙门氏菌asd基因的质粒在减毒鼠伤寒沙门氏菌X4072中的生长情况,结果表明含有鼠伤寒沙门氏菌的asd基因的高拷贝质粒pUCl9的菌株生长情况更好。为完善染色体／质粒平衡致死系统,构建减毒鼠伤寒沙门氏活菌疫苗奠定了基础。     

携带HBV包膜大蛋白DNA疫苗的减毒沙门菌在小鼠诱导免疫应答

探索一种简便、有效的乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫方法。将编码绿色荧光蛋白的真核表达质粒pEGFPN1转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,灌胃饲服BALB/c小鼠,流式细胞术检测出小鼠脾细胞内表达的绿色荧光蛋白;构建编码HBV包膜大蛋白的DNA疫苗pCIS1S2S,分别以SL7207为载体的口服途径或直接肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞反应,结果表明两种免疫途径均能在小鼠体内诱生细胞和体液免疫应答,但口服途径诱导免疫应答的强度明显强于肌肉注射途径。口服携带HBV DNA疫苗的减毒伤寒沙门菌可能代表一种简便、有效的治疗乙型肝炎的新方法。      

用志贺菌株离体传递DNA

Walter Reed Army Inst. of Research(Washington, DC)的研究者开发了一种细菌载体,可以此为基础传递口服疫苗和用于基因治疗。这些科学家用一种减毒志贺菌载体成功地离体传递质粒DNA。 这是一种向粘膜细胞传递DNA的疫苗方法,以使生成的抗原激发粘膜免疫。这样的疫苗有助于抵抗     

表达乙型脑炎病毒E蛋白重组减毒沙门菌活载体疫苗株的构建

目的:构建表达乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株。方法:克隆JEV E基因,将其插入表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-E,将重组质粒电转入鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(缺失asd、cya、crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-E);鉴定重组菌E蛋白的表达,测定重组菌的稳定性、生长曲线、安全性,以及小鼠的免疫试验和血清中和试验。结果:酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功;SDS-PAGE检测有目的蛋白条带;Western印迹证实表达的E蛋白能与猪抗JEV阳性血清特异性结合;重组菌株在体外营养选择压力下,可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可较稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾脏;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用,安全可靠;小鼠口服重组菌免疫,ELISA检测产生了抗JEV抗体;中和试验表明产生的抗体具有中和活性。结论:构建了能稳定表达JEV E蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(pYA3341-E),为研究乙型脑炎口服基因工程疫苗奠定基础。     

减毒沙门氏菌作为DNA疫苗载体的研究进展

随着沙门氏菌基因组学的深入研究以及DNA重组技术的发展,使得对沙门氏菌进行精确的不可回复性的基因缺失减毒成为可能。减毒沙门氏菌可作为DNA疫苗载体,特异性地将其携带的质粒DNA靶向性的传递给巨噬细胞、树突细胞等抗原递呈细胞,从而有效激发相应的体液与细胞免疫应答。减毒沙门氏菌已作为疫苗载体在针对细菌、病毒、寄生虫等的DNA疫苗研究中得以广泛应用。     

表达幽门螺杆菌黏附素保守区的减毒鼠伤寒沙门氏菌株的构建

为构建表达幽门螺杆菌（Hp）黏附素保守区（AB）的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗,采用缺失腺苷酸环化酶基因（Δcya）、环腺苷酸受体蛋白基因（Δcrp）以及天冬氨酸β-半醛脱氢酶基因（Δasd）的鼠伤寒沙门菌（X4072）作为宿主,将编码AB的基因插入Asd⁺的组成型表达载体pYA248,通过两次转化引入宿主菌,构建了表达AB基因平衡致死的减毒鼠伤寒沙门重组菌X4072（pYA248-AB）,采用桥联法ELISA测定X4072（pYA248-AB）培养上清液和裂解上清液中AB的抗原性,参照Meacock叙述的方法及重组菌生长曲线的测定来确定重组菌株的稳定性,通过C57BL/6小鼠口服测定半致死量来确定重组菌的安全性。成功构建了表达AB的减毒鼠伤寒沙门菌重组菌株S.typhimurium X4072(pYA248-AB),桥联法ELISA测定表明重组菌X4072（pYA248-AB）培养上清中AB的含量高于菌体裂解液,重组菌pYA248-AB在没有选择压力的情况下培养100代,随机挑选的重组菌全部都能生长,且在ELISA测定AB抗原时均显阳性。重组菌的生长曲线测定表明,X4072（pYA248）和X4072（pYA248-AB）的生长状态基本一致;口服重组菌株X4072(pYA248-AB)1.0×10¹⁰cfu.30d后,C57BL/6存活率仍为100%。成功构建了表达AB的无抗性的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗X4072（pYA248-AB）,体外实验表明重组质粒是稳定的,动物实验证明重组菌株是安全的;为防治幽门螺杆菌感染提供了口服活菌疫苗候选株。     

肿瘤生物治疗的新方法——减毒鼠伤寒沙门菌的应用

减毒鼠伤寒沙门菌由于具有肿瘤靶向性,能在肿瘤组织中复制并产生抗肿瘤效果的能力,使肿瘤治疗获得了新契机。减毒鼠伤寒沙门菌作为细菌载体使目的基因在肿瘤组织内特异表达,表现出良好治疗效果。近期研究发现,单独使用突变后的菌株A1-R在裸鼠模型上治疗乳腺癌和前列腺癌分别可达到40％和50％的治愈率;在小鼠肿瘤转移模型中也展现出良好的治疗效果。鼠伤寒沙门菌作为肿瘤治疗制剂有诱人的前景。本文就这些研究的最新进展做一综述。     

减毒活疫苗作为DNA疫苗载体的研究进展

由于胞内感染菌与宿主细胞之间的相互作用,使相应的减毒活疫苗有可能成为更为理想的DNA疫苗载体,本文就减毒活疫苗作为理想的DNA疫苗的生物学基因,研究进展,存在的问题等方面进行综述。     

鸡新城疫口服DNA疫苗的安全性、稳定性与免疫效力

将含新城疫病毒（NDV）F₄₈E₉株融合蛋白（F）基因的真核表达质粒pcDNA3-F的减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111株（ZJ111/pcDAN3-F）口服接种小鼠和雏鸡。结果表明：利用该减毒株作为载体传递DNA疫苗具有相对安全性。用酶切和PCR鉴定法证实在体内外无抗生素存在的条件下重组质粒在受体菌ZJ111菌株内比较稳定。ZJ111/pcDAN3-F以每羽10⁸cfu免疫雏鸡,2周后二免,二免后4周攻击致死剂量的强毒株F₄₈E₉,观察其免疫效力。结果表明：重组ZJ111/pcDNA3-F菌株不仅能诱导雏鸡产生抗NDV抗体,而且能诱导法氏囊B淋巴细胞和胸腺T淋巴细胞的增殖反应,对强毒株攻击的保护率为66.7%,高于pcDNA3-F裸质粒DNA疫苗注射免疫组（50%）。上述结果初步提示减毒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性,为研制低成本、实用化的口服禽类DNA疫苗奠定了基础。     

流感病毒亚单位疫苗中间体中沙门菌快速检测方法的建立

目的：建立一种能够快速、准确地检测流感病毒亚单位疫苗中间体样品中沙门菌污染的方法。方法：首先利用选择性增菌培养基对样品进行增菌培养,然后提取样品中的细菌基因组DNA,通过沙门茵特异性引物对基因组DNA进行PCR扩增,以琼脂糖凝胶电泳实现对目的片段的检测。结果：该PCR反应体系的扩增检测灵敏度可达1pg的沙门菌DNA,利用选择性增菌培养配合该PCR体系可在最快24h内实现对沙门菌的准确检测,测定结果与传统方法相符。结论：此方法应用于流感病毒亚单位疫苗中间体的沙门菌检查,较之传统的培养法结合生化鉴定的方法,大大缩短了检测周期,降低了结果判读的难度,在实际生产中有很好的应用前景。     

减毒鼠伤寒沙门菌三型分泌表达系统的构建及其特性

为开发新型重组减毒鼠伤寒沙门菌口服活疫苗载体,本研究以pYA3493质粒为基础,用鼠伤寒沙门菌sopE_(Nt100)基因及其启动子替代原有的P_(trc)启动子,构建沙门菌三型分泌表达载体pYA-sopE_(Nt100);再将质粒pYA-sopE_(Nt100)电转入沙门菌ΔcrpΔasd SL1344,构建减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100))三型分泌表达系统,研究其生物学特性,进一步将报告基因egfp克隆入sop E基因下游,构建重组菌株ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100)-egfp),感染Vero细胞,用Western blotting分析该系统递呈外源抗原的能力。PCR、酶切及测序结果表明,减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100))三型分泌表达系统构建成功;生物学特性鉴定结果表明,其血清型与亲本株Δcrp SL1344及野生株SL1344保持一致;其生化特性与亲本株基本相近,但与野毒株相比发生明显变化;生长速度也更为缓慢;重组菌株ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100))的LD50较野生株SL1344降低了7.0×104倍;Western blotting结果发现,重组菌培养上清中能检测到Sop E_(Nt100)-egfp融合蛋白(37 k Da);重组菌株感染Vero细胞后,可以同时检测到Sop E_(Nt100)-egfp融合蛋白(37 k Da)和EGFP蛋白(27 k Da)。以上结果证实,本研究成功构建了新型减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd(p YA-sop E_(Nt100))三型分泌表达系统,其能够有效递呈外源抗原,该重组菌株有潜力作为安全、稳定、高效表达外源基因的口服重组活疫苗载体。     

减毒痢疾菌为载体的HIV gag DNA疫苗的免疫原性

最近有报道指出,减毒侵袭性活菌可作为DNA疫苗的载体而被应用。在本研究中,我们将血清型为2a rfbF志贺氏菌属福氏痢疾杆菌变异株用于编码HIV-1 SF2 Gag蛋白的DNA疫苗的免疫。重组的细菌载体将gag DNA递呈给哺乳动物细胞,实现了Gag蛋白的表达,     

肠炎沙门菌SPI1缺陷突变体诱导抗鼠伤寒和肠炎沙门菌攻击的交叉免疫

<正>本论文作者研究了疫苗接种过的小鸡对沙门菌感染的免疫应答,研究了沙门菌致病岛1(SPI1)减毒的肠炎和鼠伤寒沙门菌疫苗株的血清交叉保护能力。运用实时PCR定量白细胞介素IL1β、IL17、IL22,干扰素γ(IFNγ),诱导性一氧化氮合成酶(iNOS),免疫球蛋白IgM、IgA、IgY和Ig轻链的转录物,以及急性期应答包括生物素蛋白、血清淀粉样蛋白A、细胞外脂肪酸结合蛋白(Ex-FABP)、免疫应答     

伤寒沙门菌基因组DNA芯片的制备与基因表达谱分析应用

伤寒沙门菌是一种具有鞭毛的革兰阴性人类肠道致病菌,也是一种重要的原核生物研究用模式菌．基因组芯片能够系统、全面且高效地观察生物的基因表达及进行基因组结构比较．利用伤寒沙门菌现有的全基因组序列,以Ty2菌株的基因组为基准,选取CT18菌株和z66阳性菌株的特异性蛋白编码基因,设计特异性引物,经PCR有效扩增出4 201个基因,产物纯化后点样于多聚赖氨酸玻片制备伤寒沙门菌基因组DNA芯片,并验证了芯片样点位次与效果．通过对基因表达谱分析的各种条件进行优化,建立相应的表达谱分析方法,并用于比较伤寒沙门菌野生株在高渗、低渗条件下的基因表达差异,结果与以前的报道基本一致．结果表明,成功建立了伤寒沙门菌基因组DNA芯片及表达谱分析方法,可为有关伤寒沙门菌基因表达调控及致病性机理、进化和基因多样性等方面的深入研究提供有效的技术支持．     

重组质粒在减毒沙门氏菌中的稳定性及其对细菌侵袭力的影响

将含有外源基因的重组真核表达质粒pcDNA3-F和pCI-F转化减毒鼠伤寒门氏菌,探讨质粒类型和插入片段对重组质粒在细菌内的稳定性和细菌侵袭力的影响。结果表明,外源质粒可降低减毒沙门氏菌在体外的增殖能力和侵袭力,也影响细菌在鸡体内的存活力;就质粒类型而言,pCI的影响大于pcDNA3,而以携带外源基因的重组质粒影响较为显著;外源基因插入也影响质粒在宿主菌内的稳定性。提示利用减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗研究时,要考虑质粒类型与其在宿主菌内稳定性的关系、携带外源基因重组质粒对载体菌侵袭力和存活力的影响等问题。     

伤寒沙门菌动物模型研究进展

目前伤寒沙门菌引起的人类伤寒仍是一种严重危害人类健康的疾病,且近年来多重耐药伤寒沙门菌株频频出现,使伤寒的治疗更加棘手.由于该菌具有严格的宿主特异性,又缺乏理想的动物模型,其致病机制的研究、疫苗及药物的研发受制约.新近研究发现,免疫系统人源化小鼠模型和诱导型一氧化氮合酶基因敲除小鼠模型可用于伤寒沙门菌的体内实验.本文就其应用现状及缺憾作一综述.     

rOmpF和OMVs亚单位疫苗可有效预防家禽感染肠炎沙门菌

正肠炎血清型沙门菌仍然是人类沙门菌感染病最常见的血清型,可通过受污染的食品(特别是家禽产品)感染人体。研制肠炎沙门菌亚单位疫苗不仅可以保护鸡免受沙门菌感染,还能切断沙门菌传染源。本研究分别以重组表达的外膜蛋白F (rOmpF)和提取的外膜囊泡(OMVs)制备了两种肠炎沙门菌亚单位疫苗,并在鸡中进行了肠炎沙门菌攻毒试验。结果显示,制备的亚单位疫苗不仅能诱导鸡体内产生抗体,还能引起较强的细胞免疫应答。     

细菌载体疫苗的研究进展

细菌载体疫苗是新兴现代疫苗的重要发展方向,所谓细菌载体疫苗是将所需的编码病原菌特异性抗原的DNA片段插入减毒的病原菌或者共生菌中,以提呈表达所编码的抗原,以期达到一种或多种疾病的作用。本文主要对当前研究的细菌载体疫苗加以介绍。     

肠道沙门菌O:4(B)菌群脉冲场凝胶电泳分子分型

为了明确2010年食源性疾病监测中分离的肠道沙门菌O:4(B)菌群的PFGE分子型别,探讨其多态性及其与分子流行病学关系,我们将分离获得的29株O:4(B)血清型沙门菌进一步鉴定培养,挑取单个菌落增菌,供试菌株基因组DNA用限制性内切酶Xba Ⅰ消化酶切后进行脉冲场凝胶电泳分型,所得结果用Bionumerics5.1软件进行聚类分析.实验结果表明,根据电泳指纹图谱,可将29株肠道沙门菌O:4(B)菌群分为24个PFGE型别,菌株间的相似值在56.31%~100%之间,同一血清型别的沙门菌有多个PFGE型别.脉冲场凝胶电泳对O:4(B)群沙门菌有较高的分型能力,可有效的应用于食物中沙门菌溯源分析及分子流行病学研究.     

同时口服伤寒Ty21a疫苗和注射Vi荚膜多糖疫苗的特异性和交叉反应免疫应答

正由于现有的口服全菌体伤寒沙门菌Ty21a和注射Vi荚膜多糖疫苗的保护效力很不理想,也没有抗副伤寒或非伤寒沙门菌(NTS)血清型的疫苗,应该探讨新的方法。由两个伤寒疫苗诱导的免疫学机制主要针对不同的结构。作者研究了同时使用这两种疫苗是否会提高伤寒沙门菌特异性免疫应答和抗其他沙门菌交叉应答。志愿者同时接种Ty21a和Vi疫苗(Ty21a+Vi组)或单独接种(Ty21a组和Vi组)。所有的志愿者