几丁质酶—葡聚糖酶双介基因导入滇型杂交稻恢复系提高稻瘟病抗性的研究

将含有菜豆（Phaseolus limensis)几丁质酶基因和烟草（Nicotiana tabacum)β-1,3-葡聚糖酶基因的pBLGC(16.5kb)质粒用基因枪法导入滇型杂交稻（Oryza sativa L.ssp.japonica)恢复系“南29”中,总计获得93个转化再生植株,以β-1,3-葡聚糖酶基因制备探讨对T1代株系进行Southern杂交分析,17个株系为杂交阳性,证实外源基因完整结构已整合到水稻基因组中;连续多代的PCR追踪检测证实外源基因已遗传至T4代;对所获得的6个PCR检测阳性T4代品系进行了稻瘟病菌（Magnaporthe grisea)生理小种接种鉴定和稻瘟病大田诱发鉴定,结果表明,转基因品系对稻瘟病的抗性较受体对照大幅度提高,获得了稻瘟病新抗源,但不同品系稻瘟病抗性并不相同。     

几丁质酶-葡聚糖酶双价基因导入滇型杂交稻恢复系提高稻瘟病抗性的研究

将含有菜豆(Phaseolus limensis)几丁质酶基因和烟草(Nicotiana tabacum)β-1,3-葡聚糖酶基因的pBLGC(16.5 kb)质粒用基因枪法导入滇型杂交稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)恢复系"南29"中,总计获得93个转化再生植株,以β-1,3-葡聚糖酶基因制备探针对T1代株系进行Southern杂交分析,17个株系为杂交阳性,证实外源基因完整结构已整合到水稻基因组中;连续多代的PCR追踪检测证实外源基因已遗传至T4代;对所获得的6个PCR检测阳性T4代品系进行了稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)生理小种接种鉴定和稻瘟病大田诱发鉴定,结果表明,转基因品系对稻瘟病的抗性较受体对照大幅度提高,获得了稻瘟病新抗源,但不同品系稻瘟病抗性并不相同.     

发根农杆菌介导几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因转化烟草的研究

用冻融法和三亲交配法将具有几丁质酶基因、β—1,3—葡聚糖酶基因和卡那霉素抗性标记基因的质牲pBLGC导入具有Ri质粒的发根农杆菌中。用叶盘法转化烟草的三个品种,经Kan抗性筛选获得126株再生植株,对119株再生植株分别以启动子CaMV35S、几丁质酶基因和β—1,3—葡聚糖酶基因的引物进行PCR检测,其中几丁质酶基因至阳性的植株有72株,β—1,3—葡聚糖酶基因至阳性的有47株,具有几丁质酶基因和β—1,3—葡聚糖酶基因的植株有36株。对转化的24株转基因经PCR-Southern杂交,结果均至阳性。实验结果表明,外源基因的转化频率与植物品种、外源基因片段的大小有关,几丁质酶基因和β—1,3—葡聚糖酶基因分别或共同整合到植物基因组中。     

转化双价防卫基因获得抗纹枯病水稻

将水稻几丁质酶基因(RCHIO)和苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因(AGLU)串联构建于一个表达质粒pZ100,经农杆茵介导法转化粳稻台北309,获得15个阳性独立转化子。T1代植株经Southern检测,表明外源基因已整合到了水稻基因组;经Northern检测,表明外源基因在RNA水平表达,在株系间有差异,2个酶基因的表达水平类似。T1代植株经纹枯病病茵接种鉴定,表明各株系对纹枯病具有不同的抗性,且抗病能力与2个外源基因的RNA表达水平有剂量关系,并获得了2个酶基因高表达且对纹枯病具有较高抗性的T1株系,可作为进一步进行分子育种的材料。     

双价抗真菌基因表达载体的构建及转基因西瓜的研究

构建了同时含有番茄儿丁质酶基因（Chi3）和β-1,3-葡聚糖酶基因（Glu-Ac）的双价抗真菌基因植物表达载体,以西瓜（Citrullus lanatus）子叶块为外植体,采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法,将Chi3和Glu-Ac同时导入西瓜栽培种“中育一号”,共获得46株抗性再生植株。经PCR、Southern blot和RT—PCR检测,表明外源基因己成功整合到西瓜基因组中,并在转录水平得到表达。利用尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum）对转基因植株进行离体叶片抗病性检测,表明转基因植株对枯萎病的抗性均有不同程度的增强。     

35S驱动Pib基因启动区和编码区的转基因初步分析

将包含Pib基因启动区及下游完整编码区的9.9 kb DNA片段克隆到双元载体pPZP2Ha3(+)中, 构建了35S驱动的正义表达载体pNAR701(20.3 kb); 同时将Pib基因编码区6 986~9 392 bp之间的DNA片段, 克隆到双元载体pPZP2Ha3(-)中, 构建了35S驱动的反义表达载体pNAR703(12.8 kb); 用农杆菌介导法转入中感稻瘟病水稻品种R109中。PCR、Southern blot鉴定以及转基因T0代种子的潮霉素抗性鉴定证明, 目的基因已经整合到R109基因组中, 并能在后代稳定遗传。Northern blot分析表明含有启动区及下游完整编码的Pib基因片段在35S驱动下能够在转基因后代中表达。对T1代苗期转基因植株和分蘖期离体叶片进行抗稻瘟病初步分析, 结果显示pNAR701转基因植株对稻瘟病生理小种ZD1和ZG1的抗性较对照增强, 而转反义片段的pNAR703转基因植株对稻瘟病的抗性较对照减弱。     

利用四价抗病基因提高超级杂交稻的抗性

以籼型超级杂交稻(Oryza sativa L. subsp. indica)恢复系9311的胚性愈伤组织为受体, 采用改良的基因枪轰击法将构建在同一植物表达载体上的四价抗真菌病基因(RCH10, RAC22, β-Glu和B-RIP)导入到9311的基因组中. Southern印迹杂交结果表明, 潮霉素抗性再生植株中, hpt标记基因和四价抗真菌病基因是连锁在一起并以孟德尔遗传方式进行传递的. 部分转基因R₁代和R₂代植株分别在烟溪和三亚的典型稻瘟病鉴定圃中表现出对稻瘟病菌(Magnaporthe grisea (Hebert) Barr.)的高抗性. 在高抗的转基因植株中, 多个外源基因均能正常表达. 将高抗稻瘟病的9311 R2代转基因纯系与培矮64S原种进行杂交, 杂种F₁代除对稻瘟病仍可表现出高抗性外, 还同时表现出对稻曲病和黑粉病明显提高的抗性.     

多个抗虫基因转化水稻两用系培矮—64S

应用基因枪法对水稻两用系培矮－64S进行了转化。质粒载体pKC-3串联了三个抗虫基因,将其转化成熟胚诱导形成的愈伤组织,共获得33株转基因植株。分别对R0代植株不同的基因进行PCR及Southern blot分析,并对R1代植株进行了PCR分析。结果表明,三个抗虫基因均已整合到水稻基因组并获得稳定遗传。     

几丁质酶、葡聚糖酶与萝卜抗真菌蛋白RS-AFP2基因三价表达载体的构建及农杆菌工程菌株的重组

利用基因工程技术构建了含有几丁质酶(Chitinase,Chi．)、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-Glucanase,Glu．)、萝卜抗真菌蛋白(Raphanus sativus-antifingal protein,Rs-AFP2)的三价植物表达载体,并通过农杆菌直接转化法将三价植物表达载体转入农杆菌EHA105,分别为GC R／pCAMBIA1300／EHA105和RC G／pCAMBIAl300／EHA105,并采用PCR、DNA dot blotting技术对其进行了鉴定分析,证明获得了阳性的重组农杆菌工程菌株。     

转双价水解酶基因番茄植株对枯萎病抗性的提高

利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导,首次将莱豆几丁质酶和烟草β-1,3-葡聚糖酶双价水解酶基因导入番茄品种A53(Lycopersicon esculentum cv.A53)中,获得批量转基因再生植株。对外源基因的PCR和Southern杂交结果表明,外源基因已经整合到番茄基因组中,其拷贝数1-8个不等。Northern杂交和卡那霉素喷施表明目的基因和标记基因均已得到表达,抗病性鉴定初步表明转基因植株对枯萎病的抗性显著提高。