FISH在人类未受精卵染色体异常分析中的应用

分子细胞遗传学的主要技术代表———荧光原位杂交 (FISH)是用荧光标记的依靠探针杂交原理在细胞核中或染色体上显示某一特定核酸序列的位置 ,并可进行相对定量分析 .它广泛应用于遗传病的诊断、产前诊断、肿瘤遗传学、进化遗传学研究和基因定位等领域 ,随着辅助生殖技术的进展 ,将在植入前胚胎遗传学诊断 (PGD)、生殖细胞 (卵母细胞和精子 )染色体异常的研究方面发挥更大的用途 .它是联系分子遗传学和细胞遗传学之间的桥梁 .     

植物荧光原位杂交技术的发展及其在植物基因组分析中的应用

荧光原位杂交(FISH)是在染色体、间期核和DNA纤维上定位特定DNA序列的一种有效而精确的分子细胞遗传学方法。20年来,植物荧光原位杂交技术发展迅速:以增加检测的靶位数为目的,发展了双色FISH、多色FISH和多探针FISH鸡尾酒技术;为增加很小染色体目标的检测灵敏度,发展了BAC-FISH和酪胺信号放大FISH(TSA-FISH)等技术;以提高相邻杂交信号的空间分辨力为主要目的,发展了高分辨的粗线期染色体FISH、间期核FISH、DNA纤维FISH和超伸展的流式分拣植物染色体FISH技术。在植物基因组分析中,FISH技术发挥了不可替代的重要作用,它可用于:物理定位DNA序列,并为染色体的识别提供有效的标记;对相同DNA序列进行比较物理定位,探讨植物基因组的进化;构建植物基因组的物理图谱;揭示特定染色体区域的DNA分子组织;分析间期核中染色质的组织和细胞周期中染色体的动态变化;鉴定植物转基因。     

FISH检测宫颈脱落细胞与宫颈组织中hTERC基因制片方法的研究

目的:探讨FISH实验中用直接涂片法、盐水制片法、TCT制片法、低渗滴片法制片法和宫颈切片组织取材方法对于FISH成功率的影响.方法:收集2008年3月至2009年3月青岛大学医学院附属医院妇科162例宫颈脱落细胞标本及2008年5月至2009年3月手术切除或活检的宫颈组织63例,用荧光原位杂交(FISH)方法检测hTERC基因.结果:直接涂片法、盐水制片法、生理盐水法、TCT制片法和石蜡包埋组织切片法hTERC基因杂交成功率分别为58.3%,65%,55%,87.1%,85.7%,TCT制片高于其它四组;低渗滴片法背景干净度、细胞形态、裸核数量满意度最高;TCT制片法细胞数量满意率最高;石蜡包埋组织切片法荧光信号满意率最高.结论:在检测hTERC基因的宫颈癌筛查中,TCT制片法明显优于其他方法,而在指导宫颈病变及宫颈癌的治疗中,石蜡包埋组织切片法的染色体破坏最小,实际意义更大.     

荧光原位杂交检测乳腺癌HER-2基因的应用价值

目的:探讨荧光原位杂交(FISH)在检测乳腺癌组织HER-2基因扩增的应用价值.方法:收集50例手术切除的乳腺癌标本.经过处理和切片,FISH法检测细胞HER-2基因扩增情况,IHC法检测细胞膜上HER-2蛋白表达情况.kappa检验法对两种检测结果的一致性进行统计分析.结果:FISH法与IHC法检测结果总符合率为90%(K=0.75,P<0.05).在本组胶东半岛女性乳腺癌人群中HER-2基因扩增率为28%.结论:FISH法检测乳腺癌HER-2基因敏感性及稳定性较高,可作为最终确诊HER-2基因状态的方法.     

一种基于荧光强度分析的高通量定量检测细胞凋亡方法

根据正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞的细胞膜对核酸荧光染料的不同选择通透性,用4μmol/L YO-PRO-1（YP）和4μg/ml 碘化丙啶（Propidium iodide, PI）染色96孔板中的细胞样品。分别在485/538 (Ex/Em, nm) 和530/590 (Ex/Em, nm) 的检测波长下借助荧光分光光度计检测细胞样品孔的YP和PI荧光强度。将YP和PI荧光强度值与用荧光显微镜对同一细胞样品细胞凋亡和坏死的定量分析结果相对应,通过对YP荧光强度值与凋亡细胞数的直线回归分析 (r = 0.999,P<0.01),得到依据YP荧光强度值求得凋亡细胞数的直线相关方程。该方法可检测出样品中少至180个的凋亡细胞,具有灵敏度高和快速高效的特点。     

CD138免疫磁珠细胞分选的FISH技术在多发性骨髓瘤诊断中的应用

为了分析CD138免疫磁珠细胞分选的染色体荧光原位杂交(FISH)技术在提高多发性骨髓瘤(MM)细胞遗传学异常检测敏感性的作用。本研究选取我院收治的30例确诊MM的患者为研究对象,分离骨髓单个核细胞,应用探针组合,同时采用2种方法进行细胞遗传学检测:实验组采用CD138免疫磁珠分选浆细胞后行荧光原位杂交技术(MACS-FISH)检测;对照组直接荧光原位杂交技术(D-FISH)检测。结果:30例MM患者,实验组采用CD138 MACS-FISH检出率为83.3%,对照组D-FISH法细胞遗传异常检出率为46.7%,两组差异具有统计学意义(p<0.05)。研究结果表明:分析不同类型的细胞遗传异常,MACS-FISH法1q21检出率为46.7%,RB1检出率为50.0%,Ig H检出率为70.0%,P53检出率为20.0%;D-FISH法检出率分别为23.3%,30.0%、36.7%、10.0%。通过细胞核型分析,30例MM患者中,发现5例患者为异常核型,仅为16.7%,其中1例患者为单一结构异常,复杂异常核型患者为4例。我们的研究结论表明:进行CD138免疫磁珠分选浆细胞的FISH技术在多发性骨髓瘤诊断应用中可显著提高细胞遗传学异常检测敏感性,具有临床推广应用的价值。     

RBM5荧光原位杂交探针的制备及应用

[目的]研究RBM5(RNA-binding motif protein 5)荧光探针的制备方法,确立RBM5荧光探针用于肺癌组织检测的原位杂交技术体系。[方法]以RP11-493K19菌株为材料,提取含有RBM5的质粒进行PCR验证,采用缺口平移法制备RBM5荧光探针,并与人肺癌组织石蜡切片进行杂交实验建立肺癌荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)的检测体系。[结果]RBM5 15℃标记12h可获得合适的探针,探针与样本杂交后样本细胞内出现清晰明亮的绿色荧光信号,通过与呈橘红色荧光信号的CEP-3探针比较,可以判断肺癌细胞是否存在RBM5的缺失。[结论]RBM5探针制备的最佳条件是15℃标记12h,FISH实验的参数为10μg/ml蛋白酶K处理样本100 min、探针与样本37℃杂交16h、2×SSC/0.3%NP-40洗涤杂交样本5min。该实验体系适用于肺癌组织RBM5的FISH检测。     

CRISPR技术在生物传感中的应用——胞内核酸成像、体外核酸检测与胞内DNA记录

核酸分子是生命的遗传物质和生命信息载体。如何观察细胞内外特定核酸序列,快速检测核酸序列和记录检测的细胞活动过程?这些在分子生物学领域重要的科学问题需要强有力的技术来解决。如今,在基因组编辑领域赫赫有名的CRISPR技术开始涉足上述领域。重点介绍CRISPR相关蛋白在生物传感方面的应用,包括细胞内特定基因组序列和RNA的成像、体外核酸快速检测以及细胞内DNA记录。核酸成像与核酸检测是将特定核酸序列的信息,通过CRISPR蛋白的参与转化为易检测的信号(如荧光);而DNA记录则是将细胞的代际或所接触的信号转化为细胞内DNA序列进行储存。这些新兴研究方向的开发和发展将大大促进CRISPR技术在基础科学、合成生物学、分子诊断等领域的应用。     

运用数字PCR检测乳腺癌组织FFPE样品中人表皮生长因子受体2拷贝数的变化

目的:建立数字PCR(dd PCR)法检测乳腺癌福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)切片样品中人表皮生长因子受体2(HER2)的拷贝数变化(CNV),并与免疫组化(IHC)、荧光原位杂交(FISH)结果比较,以寻求更客观、准确、通量的肿瘤标志物检测方法。方法:以细胞系293T、HOEC、SKOV3基因组DNA(g DNA)为模板,对靶基因HER2及校正基因CEP-17建立双通道dd PCR检测法,并对21例IHC检测HER2阳性(++/+++)的乳腺癌FFPE样品进行CNV(HER2/CEP-17)检测,与IHC、FISH结果比较。结果:单、双通道法对HER2 CNV检测结果一致;细胞及临床样品检测结果表明,dd PCR检测HER2 CNV的阴性、阳性Cut-off值分别为1.2、2.1,中间值为1.2~2.1。14例FISH阴性标本中,dd PCR的一致性为93%(13/14);3例IHC"+++"的样品中,FISH检测均为阳性,2例dd PCR检测为阳性,1例(17#)检测临界阳性。2例IHC"++"的样品,FISH检测阳性,但dd PCR检测为阴性。结论:dd PCR能检测样本HER2 CNV,且与FISH结果判读部分一致,具有临床应用前景,但仍需大量样品来进行验证及建立结果判断标准。     

分子诊断技术的临床应用进展

分子诊断技术主要包括核酸分子杂交技术、核酸扩增技术、基因芯片技术、基因测序技术,已广泛应用于临床各科。比如在肿瘤疾病中应用荧光原位杂交技术(FISH)检测乳腺癌中HER-2基因扩增,应用基因芯片技术检测胃癌进程中基因拷贝数变化,应用高通量测序技术(HTS)检测肺癌中的EGFR基因突变;在遗传病中应用FISH技术针对唐氏综合征进行产前诊断,应用数字PCR技术进行无创产前筛查,应用HTS技术进行Hermansky-Pudlak综合征的诊断;在感染性疾病中应用RT-PCR试剂盒进行新冠肺炎的检测,应用基因芯片技术筛选抗生素抗性基因,应用HTS技术进行耐药基因的筛选等。本文主要介绍分子诊断技术在这三大类疾病领域的临床应用最新进展。