用半定量RT-PCR方法分析小麦TaMlo-A1c基因的表达

以小麦稳定表达的肌动蛋白基因(Actin)作为对照,利用半定量反转录聚合酶链式反应(Semi-QRT-PCR)技术,对与抗白粉病有关的小麦(TriticumaestivumL.)TaMlo-A1c基因的表达进行了研究。结果发现:TaMlo-A1c基因在小麦的叶、茎、根中均表达,穗中不表达,在白粉菌(Blumeriagraminis(DC.)E.O.Speerf.sp.triticiEm.Marchal,Bgt)诱导不同时间后小麦叶片中的表达稍微有所增强。研究表明,用半定量RT-PCR技术研究小麦基因表达,具有特异性高、操作简便和可靠性强的优点。     

小麦高分子量麦谷蛋白5亚基基因的克隆及其表达载体的构建

小麦麦谷蛋白5亚基直接影响面包的烘烤品质,但我国大部分小麦品种的蛋白中缺少这种亚基。通过引物设计、PCR扩增,从Cheyenne中得到了小麦麦谷蛋白5亚基结构基因(sub5)的全长核苷酸序列(2750bp)和小麦麦谷蛋白5亚基基因启动子(Psub5)的核酸序列(630bp)。测序结果表明：得到了小麦籽粒中特异表达启动子——Psub2和用于改良小麦品质的结构基因——sub5。通过选择和改变相应的酶切位点,在构建6个中间载体的基础上,最后得到了含有目的基因的表达载体pCAM—BIAl301—Psub5—sub5—nos。酶切电泳及PCR鉴定表明：已成功地合成了sub5的表达载体。有希望通过基因工程的方法将该表达载体用于小麦的品质改良。     

RsICE1基因表达和转基因水稻抗冷通路研究

以萝卜幼苗和水稻T1代转RsICE1基因(从抗寒萝卜植株中分离的一个编码碱性螺旋-环-螺旋低温胁迫转录因子,HQ891287)株系为材料,通过半定量RT-PCR及实时定量PCR等方法,分析RsICE1基因的表达、水稻转基因株系中RsICE1基因的遗传及冷诱导基因的表达情况.结果显示:(1)半定量RT PCR分析表明,RsICE1基因在萝卜的根、茎、叶中为组成型表达,在幼苗根和茎中表达量较强;RsICE1基因的表达水平能够被冷处理和NaCl处理诱导上调表达,但ABA和脱水处理无上调作用.(2)卡方测验表明,水稻转基因T1代潮霉素抗性发生了3∶1分离模式;Southern和Northern杂交结果表明,4个抗冷转基因株系中RsICE1基因均以单拷贝、单位点整合到水稻基因组并正常表达.(3)实时定量PCR分析表明,冷胁迫下,RsICE1基因超表达但对水稻OsDREB1A(AF300970)、OsDREB1B(AF300972)、OsDREB1F(AY785897)基因表达没有影响,表明RsICE1基因对转基因水稻抗寒性的影响不依赖OsDERB1冷反应通路.     

转PvPGIP2基因小麦的获得与纹枯病抗性鉴定

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是一种植物防卫蛋白,可阻止一些病原真菌的侵害。本研究克隆出扁豆PvP-GIP2基因编码序列,构建了受玉米泛素(ubiquitin)启动子控制的PvPGIP2基因表达载体pA25-PvPGIP2;采用基因枪法将pA25-PvPGIP2转化小麦推广品种扬麦18幼胚愈伤组织4000块,获得了203株再生植株。PCR检测出阳性植株65株,转化率为1.625%。对转PvPGIP2基因小麦T1～T2植株,进行外源基因的PCR、RT-PCR、荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析和小麦纹枯病抗性鉴定。结果表明,转入的PvPGIP2能够在转基因小麦中遗传、转录与表达;PvPGIP2基因的表达提高了转基因植株对小麦纹枯病的抗性。     

普通小麦中一个类受体激酶基因的克隆、鉴定和表达分析

为研究抗白粉病小麦（Triticum aestivum L．）品系在小麦白粉病菌（Blumeria graminis f. sp．tritici）侵染后有无LRK10同源基因表达,依据小麦蛋白激酶LRK10和其它植物蛋白激酶第6亚结构域设计了一个5’-RACE兼并性引物。以接种小麦白粉病菌后的小麦抗白粉病品系“99—2439”幼苗叶片cDNA为模板进行5’-RACE扩增,获得了一个1551bp长的蛋白激酶基因cDNA片段（S1125,GenBank登录号：AY584533）。此后,通过RACE技术成功地获得了该基因的全长cDNA克隆。该克隆编码637个氨基酸组成的多肽。同源性查寻表明,该基因属于先前命名为wfrk（wheat leaf rust kinase）的小麦类受体蛋白激酶基因家族。与LRK10相似,这个新的小麦类受体蛋白激酶有5个明显的功能域：位于氨基端的疏水信号序列、推测的胞外结构域、跨膜域、高荷电序列和位于羧基端的丝氨酸／苏氨酸激酶域,因此被命名为TaLRK（Triticum aestivum LRK）。以小麦肌动蛋白基因为对照,通过半定量反转录PCR（semi—QRT—PCR）技术对叶片中TaLRK基因在小麦白粉病菌接种后的转录水平表达谱进行了研究。结果表明,小麦白粉病菌的侵染使TaLRK基因的转录显著增强。组织特异性表达分析证明,这一基因仅在小麦的绿色部分表达。研究结果提示TaLRK可能参与了小麦的抗白粉病反应。     

半滑舌鳎AKT-ineracting protein基因的克隆及免疫应答表达分析

研究克隆了半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis膜蛋白AKT-interacting protein (AKTIP)基因, 研究了其在健康组织中的表达模式、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后免疫组织和不同病原物刺激外周血淋巴细胞中的表达特征。通过常规克隆和RACE技术, 获得的半滑舌鳎AKTIP基因全长cDNA序列为1224 bp, 其中包括5'-UTR为116 bp, 3'-UTR为117 bp和完整的ORF序列891 bp, 编码296个氨基酸, 预测蛋白质的等电点(PI)为9.12,分子量是33.74 kD; 同源比对发现半滑舌鳎AKTIP的氨基酸序列在不同物种之间具有较高的保守性; 荧光实时定量PCR (qRT-PCR)检测到半滑舌鳎各个组织中均有AKTIP基因的表达, 在卵巢中表达量最高; 鳗弧菌感染半滑舌鳎后, AKTIP基因在肝、鳃、血液、肠、头肾和脾中均上调表达; 病原模拟物PGN、LPS、poly I:C和WGP刺激半滑舌鳎外周血淋巴细胞均诱导AKTIP基因下调表达。研究表明半滑舌鳎AKTIP基因参与了机体免疫反应为给半滑舌鳎免疫防御技术的研究提供理论依据。     

多发性骨髓瘤患者13q14．3区域一个候选抑瘤基因MYETSl的克隆与序列分析

为克隆位于多发性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)患者染色体13q14．2～13q21．1区域候选抑瘤基因．通过生物信息学分析获取疾病基因定位区域内代表新基因的ESTs,并运用半定量RT—PCR检测它们在正常人与MM患者骨髓组织中的表达水平,发现一条在MM患者骨髓组织中明显表达下调的EsT(cenBank收录号：H86826)．Northern印迹杂交显示H86826在骨髓组织中转录本大小为1．5kh．通过购买商品化克隆IM．AGE223589测序获得了H86826所代表的基因的1491bp全长cDNA序列(GenBank收录号：AY368652)．人类基因组命名委员会将其命名为MYETSl(myeloma tumor suppressor1)．生物信息学分析其为一个编码分子质量为15．1kD、等电点为6．13的135个氨基酸的新基因．该基因的功能正在进一步的研究之中．     

黑鲷DMRT1基因cDNA的克隆、组织表达谱及在性别逆转前后性腺中的表达

利用RT—PCR和3′-RACE的方法从黑鲷精巢中克隆丁DMRT1基因cDNA的部分序列。组织特异性表达分析表明DMRT1基因只在精巢中表达,半定量RT—PCR检测显示DMRT1基因在性别逆转前、性别逆转期和性别逆转后的精巢中的表达量无显著差异,在鱼类成体的精巢中,DMRT1的表达量可能不会因精巢结构或生理状态的改变而发生改变,而始终维持一定量的表达。     

小麦硫转运蛋白基因半定量RT-PCR检测方法的建立

为进一步研究干旱胁迫下小麦硫转运蛋白基因(ST)的表达,选用小麦-αT ubu lin基因(T a)为内参照,提取小麦根系总RNA,反转录cDNA,同批异管对2个基因片段进行PCR扩增.通过对PCR体系中M g2 浓度、退火温度及循环次数的优化和对体系重复性、准确性的分析,最终建立了一个稳定、方便的半定量RT-PCR体系.该体系可用于比较不同小麦样品间硫转运蛋白基因的表达,且因为两对引物均垮内含子,其稳定RT-PCR体系,也为实验室建立小麦mRNA反转录体系提供了参考依据.     

绵羊ESR2基因组织表达及其多态性与产羔数关联分析

为了探究雌激素受体2 (Estrogen receptor 2, ESR2)基因在绵羊各组织的表达及其多态性与产羔数之间的关系,本研究利用半定量PCR和实时荧光定量PCR技术检测ESR2基因在不同繁殖力小尾寒羊群体组织中的相对表达量,同时采用Sequenom MassARRAY誖SNP技术对多羔品种绵羊(小尾寒羊,湖羊,策勒黑羊)和单羔品种绵羊(苏尼特羊,草原型藏羊,滩羊) ESR2基因g.73324006C>T位点进行检测,并与小尾寒羊产羔数进行关联分析。半定量PCR表明,ESR2基因在单、多羔小尾寒羊子宫中高表达,在其它组织中等或低丰度表达;单羔群体、多羔群体间荧光定量PCR表明,ESR2基因在单羔小尾寒羊垂体表达量显著高于多羔小尾寒羊(p<0.05);群体遗传学分析表明,g.73324006C>T在小尾寒羊群体中表现为低度多态(PIC<0.25),在滩羊群体中处于中度多态(0.25T在小尾寒羊群体处于哈代温伯格平衡状态(p>0.05);关联分析表明,g.73324006C>T位点多态性与小尾寒羊第一胎、第二胎、第三胎产羔数及平均产羔数均显著关联(p<0.05),CC型各胎产羔数均高于TC型。与FecB (A746G)基因组合后发现,GG-CC和AG-CC基因型母羊产羔数显著高于AA-TC、AA-CC、AG-TC基因型组合(p<0.05)。综上,ESR2与小尾寒羊产羔数密切相关,g.73324006C>T可作为绵羊产羔性状选育的潜在分子标记。     

低氧对小麦根端分生细胞核仁结构和功能的影响

为了探讨低氧对小麦根端分生细胞核仁结构和功能的影响,本实验以普通小麦为材料,用低氧水处理其根尖,按常规细胞制片、银染、电镜观察、间接免疫荧光染色和半定量PCR分析等手段开展研究.观察发现:(1)低氧水处理后小麦核仁结构发生膨胀、突出、进而凝集、内部出现空泡、细微结构消失、核仁通道结构异常、甚至解体等一系列变异现象.(2)间接免疫荧光染色技术观察看到,低氧水处理后小麦核仁内的核磷蛋白B23向核质甚至胞质扩散.(3)半定量PCR分析显示,低氧处理后rRNA基因的表达量较对照明显降低,而且C23的表达信号几乎检测不到,表明核糖体RNA和核仁蛋白C23基因的表达均显著下调,低氧严重抑制它们的转录.研究证明,低氧除了对小麦根端分生细胞核仁结构有破坏作用外,还严重抑制核仁的功能.     

小麦冰重结晶抑制蛋白基因TaIRI5的克隆及分析

为了明确小麦冰重结晶抑制蛋白基因(TaIRI5)在小麦生长发育过程中的作用,该研究以小麦品种‘北京841’为材料,利用RT-PCR方法克隆TaIRI5基因,并对该基因进行生物信息学分析、组织特异性表达分析、启动子活性分析以及亚细胞定位分析。结果显示:(1)成功克隆到TaIRI5基因,该基因全长1203 bp,开放阅读框为858 bp,编码285个氨基酸,蛋白质分子量为70.7 kD,等电点为5.07,属于疏水性蛋白。(2)实时荧光定量PCR结果显示,TaIRI5基因在小麦的根、茎、叶片、雌蕊、雄蕊、护颖、种子中均有表达,其中根部的相对表达量最高,在雌蕊中表达量最低,表明该基因在小麦的生长发育过程中起重要作用。(3)TaIRI5基因的启动子分析表明,该区域除CAAT-box和TATA-box启动子核心元件外,该序列还包含9个光响应元件和6个激素应答元件及其他元件;利用TaIRI5基因不同长度(498 bp、999 bp、1500 bp)的3个候选启动子,构建了含有GUS基因的pCAMBIA1301融合表达载体;烟草转化实验表明,3个候选启动子都能启动该基因的表达,但表达模式略有差异。(4)成功构建含有GFP基因的融合载体pCAMBIA1300-TaIRI5-GFP,亚细胞定位结果显示,TaIRI5定位于细胞膜上。该研究结果为进一步研究小麦TaIRI5基因功能奠定了基础。     

小麦TaWRKY47基因的克隆与表达分析

为了探究小麦WRKY基因的功能,该研究采用RT PCR方法,在小麦叶片组织中克隆WRKY基因,并对其进行生物信息学和不同逆境胁迫下的表达分析。结果表明：(1)成功克隆得到1个小麦WRKY基因,命名为TaWRKY47。(2)TaWRKY47基因开放阅读框长度为900 bp,编码299个氨基酸,含有一个WRKY保守结构域和一个C₂HC锌指结构域,属于WRKY基因家族的第Ⅲ类成员。(3)亚细胞定位分析结果显示,TaWRKY47蛋白定位于细胞核。(4)荧光定量PCR结果表明,TaWRKY47基因在小麦根、茎、叶、雄蕊和雌蕊中均有表达,其中在雌蕊中表达量最高,且受低温、干旱、盐、ABA和H₂O₂等胁迫表达增强,推测TaWRKY47基因参与了小麦的逆境胁迫过程。该研究结果为进一步研究TaWRKY47基因功能与抗逆机制奠定了理论基础。     

普通小麦中Puroindo1ine b-2基因的分子鉴定及表达分析

Puroindoline b-2基因与小麦子粒硬度及其产量密切相关。本研究采用特异引物PCR扩增,荧光定量PCR(RTPCR)方法以及DNA测序技术,对81份国内外小麦品种(系)的Puroindoline b-2不同变异类型进行了分子鉴定,并对Puroindoline b-B2的不同变异类型在子粒、叶片以及根系部位中的表达水平进行了定量分析。结果表明,所有试验材料中的D和A基因组上均含有Pinb-D2v1和Pinb-A2v4类型,而B基因组上的Pinb-B2v3类型在所有材料中所占比例最高,为91.4%;Pinb-B2v2类型比例较低,仅为8.6%。不同变异类型间Pinb-B2基因表达量分析表明,小麦子粒中Pinb-B2v3b的表达量显著高于PinbB2v2变异类型。进一步研究表明,Pinb-B2v3b类型的相对表达量显著高于Pinb-B2v3a和Pinb-B2v3c两种类型,而此2种变异之间无明显差异(Pinb-B2v3c略高于Pinb-B2v3a变异)。不同组织间Pinb-B2基因表达量分析表明,小麦叶片中Pinb-B2的表达量显著高于根系中的表达量。本研究为进一步理解Pinb-2基因分子遗传基础提供了一定的理论依据。     

野生茄子（Solanum torvum）抗黄萎病相关基因Sto Vel的克隆与分析

采用RT—PCR和RAcE技术从野生茄子中扩增克隆到一个抗黄萎病相关基因,命名为StoVel,其cDNA全长3400bp,含有3153bp的完整开放阅读框,编码1051个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与刚果野茄、类番茄和番茄Vel编码的氨基酸序列同源性分别为82％、81％和80％,且有很高的功能区段保守性。将该cDNA全长序列提交Gen Bank,登陆号为DQ020574。半定量PCR表明该基因为组成型表达,在根中表达最多,叶中最少。     

生物异源物质对小球藻基因转录研究体系的建立(英文)

藻类是水生生态系统中的敏感物种。在环境生物学研究中,基因转录水平通常作为衡量基因表达水平变化的指标。研究建立了定量PCR技术(Real-time PCR)检测小球藻基因转录变化的研究体系。以3个主要光合作用基因(psaB、psbC、rbcL)为靶标基因,研究了除草剂草丁瞵(Glufosinate)、阿特拉津(Atrazine)和禾草灵(Diclofop-methyl)对基因转录的影响,结果表明3种供试药物对小球藻光合作用基因psbC和rbcL相对表达量有显著地抑制作用。这表明Real-time PCR可以作为评定水生环境中异源化合物毒性的有效方法。     

免疫后TCRVβ基因多态性与抗体产生的研究

研究了T细胞受体 (TCR)Vβ 在免疫后产生抗体个体和未产生抗体个体中的表达。运用RT PCR及Southernblot杂交技术 ,对 12例乙肝疫苗免疫前后健康成年人TCRVβ1 2 0基因亚家族的表达水平进行半定量研究。并运用ELISA测定了血清HBsAb阳转率。试图寻找其对Ab产生的影响。提示免疫后诱导产生了HBsAg特异的T细胞应答 ,分析免疫后Ab( )个体和Ab(- )个体的TCRVβ 基因亚家族的表达水平 ,但从目前结果统计分析还未找到其内在关系 ,可在未来的研究中寻找真正的生物限制因素     

As(Ⅲ)胁迫对小麦发芽过程中木聚糖酶活性及基因表达动态变化的影响

采用室内水培方法,研究了不同浓度As（Ⅲ）胁迫对小麦发芽过程中籽粒、幼根、幼叶3个部位在培养180h内木聚糖酶活性的动态变化。并以小麦稳定表达的肌动蛋白基因作为对照,利用半定量RT-PCR技术,对小麦木聚糖酶基因的表达进行了研究。结果表明,小麦发芽过程中3个部位木聚糖酶活性平均值大小顺序为籽粒〉幼芽〉幼根。随着As（Ⅲ）浓度升高,籽粒中木聚糖酶活性呈现低促高抑的趋势,幼根和幼叶中木聚糖酶活性呈上升趋势。4个浓度As（Ⅲ）处理后木聚糖酶基因表达强度依次为25mg／L〉5mg／L〉0mg／L〉0．1mg／L。     

‘砀山酥梨’及其褐色果皮芽变PbXET基因克隆与表达分析

为研究‘砀山酥梨’及其褐皮芽变木葡聚糖转葡糖苷酶基因(PbXET)表达水平差异,该实验利用RACE技术,克隆了梨PbXET基因;采用实时荧光定量PCR技术,分析了梨树叶片、果皮和果肉等不同组织及花后不同时期果皮中PbXET基因表达差异。结果表明:(1)梨PbXET3(KJ690921)和PbXET4(KJ690922)开放阅读框分别为903bp和891bp,分别编码300和296个氨基酸;氨基酸序列聚类分析显示,PbXET3与苹果MdXET-3以及PbXET4与苹果MdXET-5的亲缘关系最近。(2)半定量PCR分析显示,花后150d,PbXET3和PbXET4基因在‘砀山酥梨’和‘锈酥’不同组织中均有表达,且PbXET3在叶片中表达量很低,在果皮、果肉中表达相对较强,其中叶片中PbXET3表达量低于PbXET4,而果肉和果皮中PbXET3的表达均明显高于PbXET4。(3)荧光定量PCR分析发现,在‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮中,PbXET3和PbXET4基因不同时期的表达量变化趋势不同;与‘砀山酥梨’相比,果皮颜色发生变化(花后100d)之后,‘锈酥’果皮中PbXET3表达量骤减;而果皮颜色发生变化(花后100d)之前,PbXET4表达量均显著降低。由此推测,PbXET3和PbXET4基因参与了‘锈酥’果皮褐色形成的调节,其表达水平差异可能是改变‘锈酥’表皮细胞结构的重要原因之一。