质粒pBR322的温度敏感突变株

携带质拉pBR322的大肠杆菌8021经亚硝基胍诱变后,获得一批温度敏感突变株。携带这些质粒的宿主细胞在含药(氨基苄青霉素、四环素)培养基中,于30℃能正常生长,而于42℃则不能正常繁殖;接种于无药培养基中,即使42℃亦能正常生长。这些突变株中,有四株在37℃亦能表现温度敏感性。对其中一株进行了高温(42℃)敏感细胞分离的观察,在42℃时,耐药细胞数目基本稳定,而敏感细胞数目明显增加。 通过这些突变株对药物抗性的温度敏感性观察、突变质粒DNA的转化及高温分离现象,证明宿主对药物抗性的温度敏感性是由于质粒复制部分发生突变所致。 从它们的电泳及Eco RI酶解图谱来看,在突变质粒的分子量及切点数目上未看到与出发株的差异。     

对紫云英根瘤菌突变株的生长情况及产生细胞分裂素能力的考察

紫云英根瘤菌突变株96号,只有增强了原来培养基的缓冲能力并增加了氮源后,才能使其正常生长。96号突变株产生细胞分裂素的能力随着生长过程的不同而异。它产生细胞分裂素的最大量在菌体生长的稳定初期,为15.01μg/L,比出发菌株的2.18 μg/L提高了近7倍。经修改后的根瘤菌常规培养基能用于该菌株的发酵培养,并能正常产生细胞分裂素类物质。在培养液中加入腺嘌呤对菌体合成细胞分裂素类物质有强烈的诱导效应。     

PEG诱导人类细胞和元麦原生质体融合初步尝试

本实验尝试以PEG诱导Hela细胞与元麦原生质体融合进行了初步观察。 实验方法是将Hela细胞悬液250万/0.25 ml和元麦原生质体悬浮液500万/0.25 ml混合,然后加入0.125 ml PEG溶液(PEG 6,000分子量0.09M,CaCl_2·2 H_2O 10.5 mM,葡萄糖0.25 M,KH_2PO_4·7H_2O 0.7mM,pH 5.5)于37℃孵育30分钟,接着以RPMI-1640培养液洗掉PEG,离心收集细胞培养于小玻瓶中。实验分两组:一组细胞培养在Nagata培养液中,另一组培养在RPMI-1640培养液中。初步观察结果如下:     

A型流感病毒持续感染细胞系来源的IVpi-189病毒生物学性状的初步研究

为明确E61-24-P15 A型重组流感病毒的第189代传代子病毒(IVpi-189)是否具备流感病毒温度敏感减毒活疫苗候选株的特点,将IVpi-189病毒感染MDCK细胞,并于不同培养温度条件下培养,观察其致细胞病变效应,病毒合成、释放情况,以及不同温度条件下病毒存活时间。结果显示32℃培养温度下,IVpi-189病毒具有等同于亲代野生病毒株的诱导细胞病变能力,而当培养温度上调至38℃,IVpi-189病毒致细胞病变效果出现缓慢且程度明显减轻。空斑形成单位实验发现IVpi-189病毒在38℃培养条件下增殖能力明显下降,其原因与病毒灭活速度及子病毒释放无关,但与感染细胞病毒合成能力下降有关。上述实验结果初步证实流感病毒持续感染细胞系来源的IVpi-189病毒具有温度敏感减毒活疫苗的生物学特性,在许可培养温度条件下具有良好的增殖能力,而在非许可培养温度下,病毒增殖活性受到明显抑制。本研究为流感病毒减毒活疫苗的开发研制提供实验佐证。     

酵母DNA修复基因RAD16温度敏感突变株的分离及人类互补基因的鉴定

用PCR介导的基因重组法敲除酵母RAD16基因, 用羟胺处理酵母RAD16基因表达质粒, 获得RAD16基因突变库,并将其转化RAD16基因敲除的酵母细胞. 用平皿复制法获得温度敏感突变株 rad16-ts2,经互补试验证实,该突变表型为RAD16基因突变所致.将人cDNA表达文库转化rad16-ts2后筛选温度敏感拯救(rescue)表型, 回收拯救表型酵母细胞中的质粒. 测序结果表明,所获得的人cDNA克隆为HLTF/Zbu1/SMACA3基因.比较分析显示,人类该基因编码蛋白质氨基酸序列与酵母Rad16的同一性为32%,相似性则达50%.人HLTF/Zbu1/MACA3基因在HeLa细胞中过表达,可显著抑制过氧化氢损伤和UV照射诱导的细胞凋亡.     

烟草叶肉原生质体悬滴培养成再生植株

普通烟草(Nicotiana tabacum L.)“革新一号”和“柳叶”的叶肉原生质体悬浮液,在6厘米直径的培养皿皿盖反面滴7—12滴,每滴5—10微升,含200—300个原生质体。皿底内加3毫升0.4M甘露醇溶液以保持湿度。然后置于恒温中培养。经观察叶肉原生质体在NT培养液中,培养7天后发生第1次分裂,12天后形成细胞团,20几天后进一步分裂,形成肉眼可见的愈伤组织。以后将它转移到MS培养基,使其生长到一定大小的愈伤组织,再转移到诱导分化茎叶、根的培养基,获得完整的再生植株。     

一种利用STO饲养层细胞制备拟胚体的新方法

建立了一种利用STO饲养层细胞制备拟胚体的新方法。该方法选用生长至80%饱和密度的STO细胞,经丝裂霉素C(10 mg/ml)处理4 h后以8×104 cm-2的密度接种培养12 h,制备饲养层,再将ES-D3细胞以1×104 cm-2的密度接种其上,首先用含mLIF的DMEM培养液培养24 h,再更换拟胚体诱导培养液,5～9天后获得了各成熟阶段的拟胚体。形态结构和分化潜能等研究表明,该方法制备的拟胚体结构典型,具有产生3个胚层谱系来源的功能细胞的潜能。与传统拟胚体制作方法如悬滴培养法相比,具有操作简便,拟胚体形成率高,重复性好等优点,是开展哺乳动物早期胚胎发育和干细胞分化研究的理想工具。     

人类胚胎干细胞体外诱导分化为神经干细胞

人类胚胎干细胞是替代治疗充满希望的细胞来源. 描述了从人胚胎干细胞诱导分化出神经干细胞的方法. 将人胚胎干细胞系PKU1, PKU2在细菌培养皿中悬浮培养, 分化形成囊性拟胚体. 拟胚体接种至组织培养皿, 加入N2培养液和生长因子bFGF培养2周, 拟胚体贴壁、展开,中心出现灶状增生, 有突起的小细胞. 用机械方法取下此种细胞, 重新接种, 则细胞团悬浮生长,形成神经球. 培养10天后, 将神经球打散成单细胞接种, 该细胞贴壁生长旺盛. 免疫荧光检测显示为几乎100% 纯净的nestin阳性细胞. 将培养液中的生长因子撤除, 继续培养7~10天, 细胞分化为神经元, 该细胞呈现β-tubulin isotype_Ⅲ 阳性、GABA阳性、serotonin阳性、synaptophysin阳性. 在生长因子PDGF-AA诱导下, 细胞分化为星形胶质细胞, 其GFAP阳性; 或少突胶质细胞, 其O4阳性. 可见, 人类胚胎干细胞经上述方法培养可分化为典型神经干细胞, 表达神经干细胞特异的标志分子nestin、能自我更新、具有分化为神经系统三类主要细胞的能力.     

西洋参细胞悬浮培养中皂甙生物合成的代谢调节

七种真菌菌丝体诱导因子中,六种促进培养细胞的皂甙生物合成。尤其葡枝根霉作用更为明显,提高皂甙含量二倍。人参寡糖素是一种既能诱导皂甙生物合成,又能促进细胞生长的新型诱导因子,浓度为50mg／L寡糖素既能维持细胞较好生长又能提高皂甙含量,因而得到较高的皂甙产率。用四种条件培养液进行培养,结果均促进悬浮培养细胞的皂甙生物合成,其中丹参条件培养液使悬浮培养细胞的皂甙含量提高二倍多。加入皂甙生物合成主途径的三种前体,都不同程度地促进皂甙的生物合成,前体中以角鲨烯作用最为明显。     

山羊黄体细胞株细胞的凋亡

台湾大学农学院畜产学系(所)的研究人员对温度敏感的SV4 0山羊黄体细胞株(GLC D) ,在34℃时,可持续分裂,而不具类固醇生成能力,当温度升高至4 0℃时,细胞不再分裂生长,且具有合成孕酮(Proges terone)的能力,然而细胞随培养时间的增加,在洋菜胶电泳中呈现低分子量之DNA片段,显示     

组蛋白不同乙酰化位点突变对酵母细胞生长和Ssa3、Gal1基因表达的影响

组蛋白乙酰化对基因表达和细胞生长非常重要.为揭示组蛋白H3K14和H4K8的乙酰化修饰对不同条件下细胞生长和Ssa3、Gal1基因表达的重要性及二者功能差异.构建了H3K14、H4K8分别突变为精氨酸的单突变株S14、S8及二者同时突变的双突变株D814,并对其在正常、高温、咖啡因存在等条件下生长及Ssa3、Gal1表达进行比较.结果表明,所有突变株对咖啡因敏感性增加;D814对温度敏感,且在供试条件下其生长及Ssa3和Gal1激活均明显慢于野生型和单突变株;除半乳糖和葡萄糖为单一碳源,30℃时两单突变株差别不大外,其它条件下S8生长及Ssa3和Gal1激活均慢于S14.表明H3K14、H4K8乙酰化对细胞生长和适应不利环境非常重要,而且在对不利条件的快速适应方面,H4K8的乙酰化修饰可能更为重要.组蛋白突变株的表型缺陷是因该条件下细胞生存所必需的基因激活延迟所致.     

酿酒酵母组蛋白H3 K4L和K36L突变对细胞生长和GAL1、SSA3、PHO5表达的影响

组蛋白甲基化和乙酰化修饰对基因表达和细胞生长至关重要,为揭示组蛋白H3第4、36位赖氨酸(K)修饰对酵母生长和诱导基因表达的重要性及两位点功能差异,文章构建了两位点单独或共同突变为亮氨酸(L)的组蛋白突变株S4、S36和D436,对其在正常、半乳糖为单一碳源、高温、高盐等条件下的生长及GAL1、SSA3和PHO5表达进行比较。结果显示:D436对高温最敏感,各突变株对咖啡因显著敏感;3个突变株在高温、高盐、6-AU、咖啡因存在时的生长及GAL1、SSA3和PHO5的激活均明显慢于野生型;S4在高温、高盐条件下生长及GAL1激活慢于S36。H3-K4和H3-K36的翻译后修饰对细胞生长和适应不利环境非常重要,在对高温等逆境快速适应上,K4比K36更重要,组蛋白突变株的表型缺陷是因该条件下细胞生存所必需的诱导基因表达延迟所致,同一位点突变对不同基因表达有不同影响。3个突变株的缺陷表型严格上应是相应位点突变导致组蛋白修饰模式改变所造成的综合影响。     

鳗鲡肾脏细胞系的建立及其对鳗鲡疱疹病毒的敏感性

为开展鳗鲡病毒性疾病流行病学调查和病原生物学研究, 进行鳗鲡病毒的分离、培养和鉴定, 研究采用组织块培养法, 以欧洲鳗鲡肾脏组织为材料, 建立了欧洲鳗鲡肾脏细胞系(European eel kidney cell line, EEK), EEK形态呈类纤维状, 经过约12个月的培养, 已成功传至38代。通过对其培养液、血清浓度和培养温度等条件进行优化, 发现DMEM/F12、L15培养液均适合其正常生长和增殖, 而在MEM培养液中无法正常生长; 在5%—15%FBS(Fetal Bovine Serum)浓度范围内, 其生长速度随FBS浓度的升高而增快, 当FBS浓度高于20%或过低于5%时, 其生长速率有所减慢; 在22—27℃时生长良好, 但当温度低于17℃和高于32℃时细胞生长速度明显减慢。对EEK细胞进行鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus, AnHV)敏感性实验, 结果表明该细胞系对鳗鲡疱疹病毒敏感, 可产生明显的细胞病变。EEK的建立丰富了鱼类细胞系的种类, 为鳗鲡病毒性疾病诊断、病毒性病原学研究和病毒疫苗研制提供了重要实验材料。     

酵母Ndi1p突变表达文库的建立和温度敏感株的筛选

Ndi1p(internal NADH脱氢酶)是酵母线粒体电子传递链的重要组成部分,参与酵母线粒体呼吸、凋亡等多种生理活动. 本文成功建立了酵母Ndi1p突变表达文库, 随机测序表明,每个基因平均含有2个突变. 利用本文库进行了Ndi1p温度敏感突变筛选, 获得了一定数量的温度敏感型菌株, 并对温度敏感机理做了简单探索. 结果表 明,温度敏感酵母在需要Ndi1p脱氢酶活性的培养基上对温度敏感;有趣的是,这些温度敏感株细胞如果在30 ℃生长但在37 ℃测试不表现出温度敏感性,这暗示高温影响温度敏感Ndi1p的生成, 正常温度下Ndi1p正确构象一旦生成则高温不能引起Ndi1p变性. Ndi1p突变表达文库的建立对于Ndi1p参与的细胞呼吸、凋亡等过程的机理研究将有一定意义.     

防止组织培养中污染的技术措施

<正> 组织培养液具备适合于哺乳类细胞生长的各种营养成份。主要有无机盐,氨基酸和维生素组成。多数还须加入血清才能生长,血清的机制尚不十分明了。不含血清的化学综合培养基可适合于某些异倍体细胞的生长。许多学者曾创立了一些适于某特定细胞生长的培养液,所有培养液共同特点是给微生物提供了极好的生长条件。 在组织培养操作过程中,如接种或再培养均需打开容器,培养的温度又适宜,极易造成污染。何况离体细胞不如在机体中具有物理或化学的防御机能。例如人类皮肤等防止感染,就具有下列特点:①干燥表皮细胞;②多层化;③表层不断脱落;④pH在4.0—6.0,平均4.85;⑤表面披以油质,防止浸湿与浸溶;⑥角质化防止擦伤;⑦披以表     

建国以来我国自建的一些细胞株或系(三)

SMMC-7721人体肝癌细胞系材料取自50岁男性原发性肝细胞肝癌患者的手术切除标本,1977年8月用组织块静置培养和旋转培养二种方法进行培养,培养液为20%小牛血清加80%RPMI1640,培液 pH7.2—7.4,培养后11天,在接种块周围均有细胞晕生长,于培养23天传出第一代细胞,但细胞传出第一代后生长十分缓慢,经约三个月的相对静止期后细胞才开始稳定而迅速的生长。     

九连小檗悬浮培养细胞生理生化特性的研究 Ⅴ．细胞生长与呼吸作用及对主要营养元素吸收、消耗的关系

叙述了九连小檗细胞悬浮培养细胞生长与呼吸作用及对主要营养元素吸收消耗的关系。细胞接种于新鲜培养液中,呼吸作用强度和对主要营养元素的吸收,消耗便迅速增加。接种后第６天,培养液中ＰＯ４＾３＾－几乎被耗尽,Ｋ＾＋和ＮＯ３的浓度也减少一半,细胞生长由延迟期进入起始生长期。至第８天呼吸强度达到高,细胞生长加,但细胞生长高峰延迟于呼吸高峰。随后,营养物质的消耗减少,呼吸降低,生长减慢,至静止期细胞生长停止,呼     

骨髓间充质干细胞抑制小胶质细胞介导的炎症反应

目的研究骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMMSCs)对小胶质细胞介导的炎症反应的抑制作用。方法实验分为四组:组一:小胶质细胞(BV2)生长于DMEM(High Glucose)培养液中;组二:BV2细胞生长于加入脂多糖(LPS)的上述培养液中;组三:BV2细胞、BMMSCs共培养于加入LPS的上述培养液中;组四:骨髓间充质干细胞(BMMSCs)生长于加入LPS的上述培养液中。观察BV2细胞的生长状态、电镜超微结构变化及其分泌的炎症因子TNF-α表达量的变化。结果光镜下BV2细胞密度依次为:组一组三组二,组四中BMMSCs生长状态良好;电镜下可见组二BV2细胞内出现大量肿胀及空泡化的线粒体、内质网等细胞器,少见生长活跃多核仁细胞,同时可见大量崩解细胞,组三细胞状态明显好于组二;BV2细胞分泌的炎症因子TNF-α表达量依次为组二组三组一组四。结论 BM-MSCs抑制小胶质细胞介导的炎症反应,进而发挥神经保护作用。     

脐带间充质干细胞诱导分化为类许旺细胞的实验研究

目的:探讨通过化学诱导的方法,诱导脐带间充质干细胞分化为类许旺细胞,为组织工程神经寻找一种新的种子细胞来源。方法:通过酶消化法,分离获得原代脐带间充质干细胞。体外培养至第3代(P3),以1×103/cm2接种于培养瓶中,待细胞长至亚融合状态,吸弃培养液,加入含β-巯基乙醇的培养液预诱导24 h。然后,加入含有全反式维甲酸的培养液进一步诱导72 h。最后,加入含有胶质细胞生长因子的培养液,作用两周。对诱导后的脐带间充质干细胞用免疫荧光及RT-PCR法,进行形态观察和表型鉴定。结果:经过上述诱导过程,脐带间充质干细胞的形态,由开始时的扁平、片状、多极,类似成纤维细胞状,逐渐变为长梭形,双极或三极,类似许旺细胞。同时,表达许旺细胞特异性标志S-100、P75;而且S100,P75的m RNA水平也明显上调,并且可以观测到GFAP的m RNA条带。结论:化学诱导法,可以将脐带间充质干细胞诱导分化为类许旺细胞,有望为组织工程神经提供一种新的许旺细胞来源。     

九连小檗悬浮培养细胞生理生化特性的研究 Ⅴ．细胞生长与呼吸作用及对主要营养元素吸收、消耗的关系

叙述了九连小檗细胞悬浮培养中细胞生长与呼吸作用及对主要营养元素吸收消耗的关系。细胞接种于新鲜培养液中,呼吸作用强度和对主要营养元素的吸收、消耗便迅速增加。接种后第６天,培养液中ＰＯ４３－几乎被耗尽,Ｋ＋和ＮＯ３－的浓度也减少一半,细胞生长由延迟期进入起始生长期。至第８天呼吸强度达到高峰,细胞生长加速,但细胞生长高峰延迟于呼吸高峰。随后,营养物质的消耗减少,呼吸降低,生长减慢。至静止期细胞生长停止,呼吸作用微弱。这些结果为优化培养条件,改进培养基组成,调控细胞生长和代谢提供了参考。