烟草质体分裂蛋白NtFtsZs在大肠杆菌中的定位分析

分别构建了两个烟草 (NicotianatabacumL .)质体分裂基因NtFtsZ1和NtFtsZ2与编码绿色荧光蛋白的gfpS65A、V68L、S72A基因相融合的原核表达载体 ,并导入大肠杆菌 (Escherichiacoli)JM10 9菌株中进行表达。全长NtFtsZs∶GFP融合蛋白在菌体中有规律地定位 ,暗示NtFtsZs能识别大肠杆菌潜在的分裂位点 ,并能与大肠杆菌的内源FtsZ发生聚合作用 ;融合蛋白的诱导表达抑制了宿主菌的分裂 ,形成了明显的丝状菌体 ,证明真核生物的ftsZ基因与大肠杆菌的ftsZ基因有相似的作用。同时构建了NtFtsZs不同缺失的原核表达载体 ,对这两个基因所编码蛋白不同结构域的功能做了初步分析。实验结果表明 ,烟草FtsZ蛋白的C端结构域与其在大肠杆菌细胞中的正确定位有关 ;而N端结构域与NtFtsZs∶GFP融合蛋白的聚合有关。     

平颏海蛇PLA2在大肠杆菌中的融合表达

将编码平颏海蛇磷脂酶A2的基因(PLA29)分别克隆于硫氧环蛋白基因融合表达载体pThioHisC和pTRX的HP\|trxA和trxA基因的3′末端,构建符合读码框的融合表达载体pThioHisC\|PLA2和pTRX\|PLA2。25℃下经IPTG诱导,PLA2融合蛋白在两种原核系统中均能获得较高表达,但PLA2在pTRX系统下的表达量和蛋白溶解性优于pThioHisC系统。将两种系统下的表达产物进行金属螯合亲和层析纯化,Trx\|PLA2融合蛋白的纯度可达85%以上,而HPTrxPLA2不表现出对介质的亲和性,难以得到纯化。由此,将pTRX\|PLA2载体系统确立为进一步大量表达和纯化的载体系统。     

球形芽孢杆菌C3-41二元毒素基因在苏云金芽孢杆菌以色列亚种中的克隆和表达

球形芽孢杆菌C3-41是我国分离的一株对蚊幼虫有毒杀作用的高毒力菌株,对库蚊、按蚊幼虫的毒性高于2362菌株,Southern杂交证明C\-3\|41总DNA中35Kb HindIII片段上带有419和514kD二元毒素基因,该片段由3479个核苷酸组成,核苷酸序列同2362菌株的二元毒素基因序列完全相同。含二元毒素基因的重组质粒pCW\|1和pCW\|2能在大肠杆菌中表达产生二元毒蛋白,但表达量低,重组子杀蚊毒性低。无晶体型苏云金芽孢杆菌以色列亚种重组子在其芽孢形成中能产生以晶体形式存在的二元毒素蛋白,其全发酵液和纯化晶体蛋白的杀蚊活性与C\-3\|41相近。     

F3-PE40基因的克隆、表达及纯化

通过质粒提取、PCR扩增构建F3-PE40表达载体转化大肠杆菌,然后进行表达纯化。以pEKH-F3质粒为模板,PCR扩增F3片段,将F3插入克隆质粒PQE80L,转化大肠杆菌,筛选获得含有F3的PQE80L重组载体。提取绿脓杆菌菌株染色体DNA为模板,PCR扩增绿脓杆菌外毒素A催化区（PE40）。然后将PQE80-F3和PE40重组,得到表达PQE80L-F3-PE40载体。转化至大肠杆菌DH5a,BL21,表达融合蛋白F3-PE40。大肠杆菌表达了融合蛋白F3-PE40,表达的融合蛋白量占菌体总体蛋白量的20%。成功地表达了融合蛋白F3-PE40,为进一步大规模表达、纯化F3-PE40功能奠定了基础。     

烟草质体分裂蛋白NtFtsZs在大肠杆菌中的定位分析

分别构建了两个烟草(Nicotiana tabacum L.)质体分裂基因NtFtsZ1和NtFtsZ2与编码绿色荧光蛋白的gfpS65A、V68L、S72A基因相融合的原核表达载体,并导入大肠杆菌( Escherichia coli ) JM109菌株中进行表达.全长NtFtsZs∶GFP融合蛋白在菌体中有规律地定位,暗示NtFtsZs能识别大肠杆菌潜在的分裂位点,并能与大肠杆菌的内源FtsZ发生聚合作用;融合蛋白的诱导表达抑制了宿主菌的分裂,形成了明显的丝状菌体,证明真核生物的 ftsZ 基因与大肠杆菌的 ftsZ 基因有相似的作用.同时构建了NtFtsZs不同缺失的原核表达载体,对这两个基因所编码蛋白不同结构域的功能做了初步分析.实验结果表明,烟草FtsZ蛋白的C端结构域与其在大肠杆菌细胞中的正确定位有关;而N端结构域与NtFtsZs∶GFP融合蛋白的聚合有关.     

肺炎球菌表面蛋白的克隆表达与免疫原性研究

从肺炎球菌YF05中扩增了肺炎球菌表面蛋白A（PspA）和肺炎球菌表面黏附素A（PsaA）基因,以pET27b(+)为载体构建了重组表达质粒的表达系统后,转化入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的75％,结果显示：表达的PspA蛋白和PsaA蛋白,分子量分别约为75kDa和37kDa。成功表达的重组蛋白具有较强的免疫活性和交叉免疫效果。     

稀有密码子对hIL-5 cDNA在大肠杆菌中表达及细菌生长影响的研究

我们通过重组PCR技术将hIL-5 cDNA中部及3′端的稀有密码子改为大肠杆菌偏性密码子,包括编码88位Gly的GGA、91～93位3个Arg的AGACGGAGA和113～114位2个Ile的(ATA)。将测序后的hIL-5片段插入pBV220,转化大肠杆菌DH5α获得重组菌株pBVhIL5-H/DH5α。经热诱导在大肠杆菌获得高效表达,表达量占菌体总蛋白的16.5％,达到国外全合成基因在大肠杆菌表达的高限水平,表达的hIL-5重组蛋白在菌体中以包含体形式     

鼠疫菌V抗原基因在大肠杆菌中的克隆及表达

从鼠疫杆菌野毒株总DNA中利用PCR方法扩增出V抗原编码基因,将此基因克隆到大肠杆菌的表达质粒pET42b(+)中,经IPTG诱导后,在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中成功地表达出鼠疫菌V抗原蛋白。目的蛋白表达量占菌体总蛋白的32.8%。     

在大肠杆菌中高效表达人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)核心蛋白

将编码人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)核心蛋白(Gag)P24的大部分基因片段,插入大肠杆菌表达载体pEX31A中,获得的表达产物MS2-Gag融合蛋白占菌体总蛋白的20％左右。Western blot结果证明,这种表达产物能被艾滋病(AIDS)患者血清中的特异性抗体所识别。这是国内首次报道在大肠杆菌中高效表达人类免疫缺陷病毒Ⅰ型核心蛋白。对表达的重组核心蛋白的意义及应用前景进行了讨论。     

苏云金杆菌vip3A基因的克隆、表达及杀虫活性分析

用全长PCR方法从野生型苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis ,Bt)菌株S184中克隆了2.3kb大 vip3A基因并进行了序列分析。将vip3A-S184基因插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP,转化大肠杆菌M15,转化子经1mmol/L IPTG诱导后可表达89kD大小的Vip3A-S184蛋白,并得到Western blot证实。蛋白可溶性试验表明,目的蛋白中约有19％是可溶的,用透射电镜观察到大多数蛋白是以包涵体形式存在的。因此,可以在自然条件下进行目的蛋白的纯化和对家兔进行免疫制备多克隆抗体,用于苏云金杆菌Vip3A蛋白表达的检测。利用IPTG进行诱导培养的菌液对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）,斜纹夜蛾（S.litura)和棉铃虫（Helicoverpa armigera)等3种害虫的初孵幼虫进行生物测定,结果表明,Vip3A-S184蛋白对夜蛾科害虫具有较高的杀虫活性。     

番茄内质网ω-3脂肪酸去饱和酶基因原核表达载体的构建与鉴定

通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到内质网ω-3脂肪酸去饱和酶(LeFAD3)基因的部分编码区,该片段cDNA为309 bp,将其克隆到pET-30a(+)载体中,酶切位点分别是BamH I和Sac I,构建了原核表达载体pET-LeFAD3,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,经IPTG诱导蛋白表达,提取蛋白并采用SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况.酶切鉴定结果表明,LeFAD3基因原核表达载体构建成功,目的蛋白成功表达.     

抗辐射菌属-大肠杆菌间的穿梭载体的构建及荧光基因的表达

摘要：【目的】构建抗辐射菌属一大肠杆菌间的穿梭载体,通过此载体使荧光素酶基因在大肠杆菌中得到表达。【方法】以质粒pUE30、pGBM5及pKatCAT为基础,构建抗辐射菌属一大肠杆菌间的穿梭载体,将groEL启动子和荧光素酶基因lux+插入到构建的穿梭载体中得到穿梭表达载体,并将该载体转化大肠杆菌诱导荧光素酶基因的表达。【结果】成功构建了大小约为5.8 kb的抗辐射菌属一大肠杆菌间的穿梭载体pZT17,该载体在没有抗生素的非选择性培养基中能稳定存在。在穿梭载体pZT17的EcoRV部位插入含有groEL启动子和荧光素酶基因lux+的DNA片段,构建得到了穿梭表达载体pZTGL2;利用该表达载体在大肠杆菌中可诱导表达荧光素酶基因。【结论】构建的穿梭表达载体为以后用大肠杆菌高效表达来源于抗辐射菌的基因、特别是DNA损伤修复蛋白基因,提供了可能。     

牛BVDV C_(24)V株P80蛋白在大肠杆菌中的高效表达

根据GenBank中已发表的牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)P80基因序列,自行设计并合成引物,经过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从BVDV C_(24)V株细胞培养液中扩增出P80基因,大小为560bp。利用酶切方法把目的基因克隆到大肠杆菌IPTG诱导表达载体PET32a(+)中,在大肠杆菌中得到了高效表达,这为建立ELISA方法检测BVDV抗体奠定了基础。     

中华眼镜蛇短链神经毒素cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用RT－PCR技术从中华眼镜蛇毒腺组织中成功地克隆了短链神经毒素CDNA。测序结果表明,该基因开放阅读框架编码83个氨基酸残基,其中对个为信号肽,成熟肽为62个氨基酸残基。该基因与GenBank报道的相同物种的神经毒素基因有相当的同源性,不同物种之间的信号肽序列十分保守。将短链神经毒素CDNA再经PCR扩增除去信号肽序列,克隆到pT7ZZ表达质粒中,转化E.coliBL21（DE3）后,经IPTG诱导可高效表达分子量为23kDa②左右的融合蛋白。表达产物占菌体总蛋白的25％左右。     

双顺反子翻译偶联表达载体的构建及蚓激酶基因F238在大肠杆菌中的可溶性表达

为了实现外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,利用硫氧还蛋白作为分子伴侣构建双顺反子翻译偶联表达载体pDICT。将大肠杆菌硫氧还蛋白基因插入到pET22b载体NdeI和EcoR I位点之间,同时在硫氧还蛋白编码基因的终止密码子前加入核糖体结合位点,构建成双顺反子翻译偶联表达载体pDICT。将蚓激酶基因F238克隆到该载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达。SDS-PAGE结果表明,所表达的蚓激酶F238是可溶性蛋白。利用血纤维蛋白法对表达产物进行活性测定,重组蚓激酶F238不仅具有纤溶酶活性,而且具有激活纤溶酶原的激酶活性。该双顺反子翻译偶联表达载体的构建,为在大肠杆菌中可溶性表达外源蛋白提供了新方法。     

具超强富集U(Ⅵ)能力工程菌E.coli的构建

以鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到非特异性酸性磷酸酶基因（phoN）,将其克隆到pMD18T-Vector中。用Spe I、Nde I限制性内切酶对重组转移载体T-VectorphoN与穿梭载体pRADZ3分别进行双酶切,再将phoN片段和穿梭载体pRADZ3中的大片段通过T4DNA连接酶连接。经PCR与双酶切双重鉴定,证实重组穿梭载体pRADZ3phoN构建成功。转化Escherichia coli DH5α感受态细胞,使其在正常情况下表达PhoN蛋白,经Western blot 证实phoN基因在DH5α中成功表达。利用含pRADZ3phoN的工程菌进行富集U(Ⅵ)实验,结果表明该工程菌对U(Ⅵ)的富集量较宿主菌提高约4倍,达46.16mg/g,去除率为92.32%。     

鸭源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛pilA基因的原核表达及重组蛋白对强毒攻击的免疫保护作用

根据GenBank中人源大肠杆菌pilA基因序列,用OLIGO6.0设计PCR引物,从鸭源致病性大肠杆菌GH1.2中扩增到pilA基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将鸭源致病性大肠杆菌pilA基因正向插入原核表达载体pET-32a( )的BamHⅠ和HindⅢ位点间,成功构建了重组表达质粒pET-32a-pilA。重组表达质粒pET-32a-pilA转化表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导,表达出了大小约为36kD的pilA重组蛋白。表达产物用镍柱亲和层析纯化,与等量弗氏佐剂混合制备pilA重组蛋白疫苗,分别在1日龄、8日龄时两次对雏鸭进行免疫,二免后2周测定鸭血清中的ELISA抗体效价,并以109PFU同源菌株GH1.2攻毒,根据攻毒后鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变等级来判定pilA重组蛋白的免疫保护效果。结果pilA重组蛋白免疫鸭的血清中ELISA抗体效价为1∶12800,全菌灭活苗免疫组的血清ELISA抗体效价为1∶200;同源菌株攻毒后,pilA重组蛋白免疫保护组鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变程度均比攻毒对照组下降且差异显著或极显著,与全菌灭活苗免组比较差异不显著。表明pilA重组蛋白对同源菌株GH1.2的感染具有一定的保护效果。     

丙酮酸甲酸裂解酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及酶学性质的研究

丙酮酸甲酸裂解酶（pyruvate format-lyas,PFL）是厌养或兼性厌养微生物中,代谢途径的关键酶之一,为了进一步研究其功能,我们以大肠杆菌JM109菌株基因组DNA为模板,进行PCR扩增大肠杆菌中的pfl基因,为测序方便将所得DNA片段连接到pMD18-T载体上,将测序正确后的pfl基因连接到表达载体pET-22b(＋)中,重组表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达, 通过SDS-PAGE电泳分析,在分子量为85kDa处出现新生的蛋白条带。利用金属亲和层析对添加了6×组氨酸标签的PFL进行纯化,对PFL的酶学性质进行了研究。结果表明：此酶的最适温度为35 ℃,最适pH为7.5,米氏常数Km＝2.3mmol,Tm＝49.9℃。     

热休克蛋白HSP65嵌合表达系统的构建和表达

设计一条含(GlySer)3连接肽的引物,从BCG经PCR得到HSP65-Linker的基因片段。将该基因定向克隆入原核表达载体pET42b(+),用大肠杆菌BL21(DE3)转化,构建了pET42-LHSP65的嵌合表达载体。DNA测序正确后经IPTG诱导表达,得到可溶性目的蛋白,Western-blot也证实了此重组蛋白可与抗HSP65发生特异性免疫反应。此重组体的构建为进一步探索HSP65的免疫佐剂功效奠定了基础。