甘蔗ScMOC1基因启动子的克隆与瞬时表达分析

MOC1属于植物特有的GRAS家族蛋白基因,是调控植物腋芽形成发育的关键基因。启动子对基因转录效率起直接调控作用,其功能分析可以精确定位基因的表达部位、发育阶段和调控机制,克隆甘蔗腋芽形成发育关键基因ScMOC1的启动子序列,研究其功能对该基因表达调控机制具有重要意义。本研究以我国主栽甘蔗品种新台糖22号(ROC22)的基因组DNA为模板,通过基因组步移和巢式PCR技术克隆到ScMOC1起始密码子ATG上游1874 bp的启动子序列。PlantCARE在线分析预测表明,该序列包含多个真核生物启动子必需的核心元件TATA-box、CAAT-box以及与光响应、激素响应和分生组织表达等相关的顺式作用元件,推测ScMOC1启动子可通过激素诱导调控ScMOC1表达,且该启动子可能通过分生组织表达顺式调控元件CAT-box参与ScMOC1对甘蔗分蘖的调控。将获得的启动子序列替换pBI121质粒中的CaMV35S启动子驱动下游GUS基因表达进行活性分析,结果表明:本研究克隆的启动子片段能驱动GUS基因在甘蔗嫩叶中瞬时表达。5′缺失分析表明该启动子的基础启动子序列在起始密码子ATG上游350～500 bp之间。该结果为后续ScMOC1的调控机制研究奠定了良好的基础。     

枣树内参基因ZjH3的克隆与筛选

为了克隆和筛选适合于枣树(Ziziphus jujuba Mill.)基因表达研究用的内参基因,利用枣结果枝cDNA文库ESTs序列,克隆获得4条其它物种常用内参基因的同源基因:组蛋白H3的同源基因全长序列,命名为ZjH3(Ziziphus jujubaH3,GenBank登录号:EU916201);肌动蛋白的同源基因片段,命名为ZjAT1(Ziziphus jujubaACT,GenBank登录号:EU251882);泛素延伸蛋白同源基因全长序列,命名为ZjUBQ(Ziziphus jujubaUBQ,GenBank登录号:EU916200);翻译延伸因子的同源基因片段,命名为ZjEF1(Ziziphus jujubaEF,GenBank登录号:EU916202)。在相同的条件下,用半定量RT-PCR方法分析了这4个潜在内参基因在枣不同生长时期的结果枝及其茎尖和不同器官中的表达,结果表明,ZjAT1、ZjUBQ和ZjEF1基因的表达不恒定,不适合用作枣树内参基因;而ZjH3基因在不同发育阶段的结果枝及其茎尖、根、茎、叶、芽、花蕾、花、幼果、膨大果实和种子中均表达稳定,适合于用作枣树的内参基因。     

甘蔗金属硫蛋白基因(ScMT2-1-4)的克隆及表达分析

从甘蔗热带种Badila(Saccharum officinarum L.)中克隆获得1个2型金属硫蛋白基因的c DNA序列,命名为Sc MT2-1-4(Gen Bank登录号:KJ504375)。生物信息学分析显示,Sc MT2-1-4基因c DNA长459 bp,开放读码框为243 bp,编码80个氨基酸,富含14个半胱氨酸残基。推导的Sc MT2-1-4蛋白为亲水性蛋白,分子量为7.82 k D,等电点为5.59,该蛋白的二级结构由无规则卷曲和延伸链构成。实时荧光定量PCR检测结果显示,Sc MT2-1-4基因是重金属胁迫的快速响应基因,其对Cu2+、Zn2+和Cd2+胁迫的应答模式提示了:甘蔗不同组织中Sc MT2-1-4对Cu2+胁迫应答的分功不同;Sc MT2-1-4对甘蔗抵御Zn2+胁迫起积极的作用;但该基因不直接参与甘蔗对Cd2+的螯合和解毒的过程。研究结果有助于进一步深入探究MT2基因在甘蔗应答重金属胁迫过程中的作用,为阐明甘蔗富集和耐受重金属的分子机制研究奠定基础。     

甘蔗KNOX基因(Sckn1)的电子克隆及生物信息学分析

KNOX基因对植物顶端分生组织的形成和维持有至关重要的作用。本文选择功能已知的水稻KNOX基因(OSH1,Oskn1)为参考序列,采用电子克隆技术克隆到甘蔗中与OSH1同源的一个KNOX基因Sckn1,并通过生物信息学分析预测该基因的结构、功能。结果表明:该基因包含一个1 071 bp的开放阅读框,编码356个氨基酸,分子量为39.36 kD,理论等电点为6.47。该基因很可能定位于细胞核,起转录调控作用,序列比对发现该基因编码蛋白与高粱、玉米、小米草等KN1蛋白高度相似。以上分析结果为进一步研究Sckn1基因的功能奠定了坚实的基础。     

甘蔗几丁质酶基因ScChiⅣ1的克隆、序列分析及其表达

几丁质酶(Chitinase,EC 3.2.2.14)参与植物的生长发育及防卫反应。本研究借助电子克隆技术,以甘蔗(Saccharum spp.)抗黑穗病基因型崖城05-179针刺接种黑穗病菌(Sporisorium scitamineum)48 h的蔗芽c DNA为实验材料,克隆获得一个甘蔗几丁质酶c DNA序列(Gen Bank登录号:KP165001),命名为Sc ChiⅣ1。生物信息学分析结果显示,该核苷酸序列全长为1 037 bp,包含1个长为825 bp的完整开放读码框,编码274个氨基酸,理论等电点为8.29。该基因推导的编码蛋白属于糖苷水解酶19家族成员,含信号肽和几丁质结合区,胞外定位的概率为0.820,推测Sc ChiⅣ1是一种胞外分泌蛋白,同时兼具溶菌酶活性。聚类结果显示,Sc ChiⅣ1归属于ClassⅣ几丁质酶基因。荧光定量PCR分析显示,甘蔗接种黑穗病菌后的96 h内,抗、感基因型中Sc ChiⅣ1表达量均高于对照,且在亲和互作中Sc ChiⅣ1转录本上升应答快(6 h),并在接种黑穗病菌后96 h持续更长,其在甘蔗不同黑穗病抗/感基因型材料(崖城05-179/柳城03-182)与黑穗病菌互作中的表达模式存在差异,但总体结果表明Sc ChiⅣ1受黑穗病菌胁迫诱导表达。本研究为后续甘蔗几丁质酶功能鉴定及甘蔗抗黑穗病基因工程研究奠定基础。     

小麦分蘖角度TaTAC1基因同源克隆及表达分析

分蘖角度影响植物群体结构、光合效率以及植株的形态建成,最终影响其产量及品质。小麦中关于分蘖角度的研究鲜有报道。前人研究显示,水稻OsTAC1正向调控分蘖角度的大小,玉米Zm TAC1与叶片角度呈正相关。本研究的目的是解析Ta TAC1的表达模式并初步了解该基因的分子遗传机制及其与分蘖角度的遗传关系。本研究以CN16、SM969、Lan2399、SHW-1为材料,利用同源克隆分离获得Ta TAC1,利用生物信息学软件对Ta TAC1进行序列特征分析,应用实时荧光定量PCR对其表达模式进行分析,并进行Ta TAC1蛋白的亚细胞定位分析。结果显示,Ta TAC1长度约1.1~1.2 kb,包括780 bp的完整开放阅读框和320~370 bp的3'-UTR。Ta TAC1的c DNA序列分为2类,其中CN16-2、SM969-2的第10号碱基发生突变,引起终止子提前,导致Ta TAC1表达受阻;Lan2399-2和SHW-1-2在109~115碱基位置有"CGCGCG"片段插入,导致蛋白质β-折叠片减少。表达分析表明,Ta TAC1在分蘖期的叶鞘、茎高效表达,分蘖节其次,叶与根表达量最低。相关分析表明该基因在分蘖节各时期表达量与分蘖角度呈显著正相关,Pearson相关系数为0.677,其他组织表达量与分蘖角度无显著相关性。亚细胞定位分析显示Ta TAC1定位于细胞膜。从上述结果可以推测Ta TAC1在mRNA水平上正向调控分蘖角度,且可能参与生长素极性运输过程从而改变分蘖角度大小。     

稻属单拷贝核基因TPI序列分析及其在疣粒野生稻鉴定中的应用

通过对稻属(Oryza L.)及其近缘属等18个禾本科植物单拷贝核基因TPI序列进行扩增和测序,分析其系统进化关系及序列差异,并设计鉴定疣粒野生稻(O.granulata)特异的分子标记.序列分析表明,栽培稻间TPI基因序列碱基变异少,野生稻相对变异丰富,其中疣粒野生稻变异尤为明显,根据疣粒野生稻的TPI基因序列特异位点设计引物,利用这一分子标记对疣粒野生稻进行准确鉴定.     

水稻硒结合蛋白基因OsSBP的克隆、表达及生物信息学分析

为了探究水稻硒结合蛋白(selenium-binding protein, SBP)基因的功能,以水稻品种日本晴(Oryza sativa Japonica)为材料,采用同源克隆法获得Os SBP,并对其进行组织特异表达及生物信息学分析。结果表明,Os SBP基因cDNA序列为1 623 bp,包括长度为1 449 bp的CDS,碱基组成为A 23.3%、T 25.1%、G 28.9%、C 22.6%,编码482个氨基酸残基组成的蛋白质。Os SBP蛋白表现为弱酸性,且稳定、亲水;二级结构中以无规则卷曲和延伸链结构为主,三级结构同源建模成功,主要是螺旋和转角;亚细胞定位Os SBP主要分布在细胞质中,推测可能在运载结合、辅助因子中发挥重要作用,无跨膜结构域,无信号肽;该蛋白序列中存在24个丝氨酸磷酸化,11个苏氨酸磷酸化位点和10个酪氨酸磷酸化位点以及6个糖基化位点。启动子元件分析表明,其含有与热胁迫、干旱胁迫、光反应、细胞防御、赤霉素(GA)和茉莉酸甲酯(MeJA)信号传导相关元件。进化分析结果表明,克隆的Os SBP氨基酸序列与短柄草、高粱的同源关系较近,具有较高的保守性,与莱茵衣藻的同源关系较远。RT-PCR分析结果表明,Os SBP基因在各组织中均有表达,水稻孕穗期中茎的表达最高,其次分别为叶和根,穗中表达量最低,且该基因的表达受Cd,盐和热的诱导,以及PEG和Cold的抑制。该基因的成功克隆及分析为进一步研究Os SBP在水稻抗逆中的作用奠定了重要的基础。     

马铃薯腐烂茎线虫L 型半胱氨酸蛋白酶新基因(Dd-cpl-1) 的克隆与序列分析

L型半胱氨酸蛋白酶基因 (Cathepsin L-like cysteine proteinase gene) 为与植物寄生线虫寄生能力相关的多功能基因。运用RT-PCR和RACE的方法从马铃薯腐烂茎线虫Ditylenchus destructor中克隆出1个L型半胱氨酸蛋白酶新基因Dd-cpl-1 (GenBank登录号为GQ180107)。该基因Dd-cpl-1 cDNA全长序列含有1个1 131 bp的开放性阅读框 (ORF),编码376个氨基酸残基,其5′末端及3′末端分别含有29 bp和159 bp的非编码区 (UTR)。Dd-cpl-1内含子外显子结构分析结果表明,其基因组序列包含7个内含子,且各内含子两端剪接位点序列遵守GT/AG规则。Dd-cpl-1基因推定的蛋白Dd-CPL-1与松材线虫L型半胱氨酸蛋白酶高度同源,一致性达到77％。以不同物种中L 型半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列进行比对分析,推测推定的蛋白 Dd-CPL-1含有L型半胱氨酸蛋白酶基因家族高度保守的催化三联体 (Cys183,His322 和Asn343) 以及ERFNIN基系和GNFD基系。半胱氨酸蛋白酶系统发育分析表明,Dd-cpl-1 属于由L型半胱氨酸蛋白酶组成的进化分支。Dd-cpl-1的这些序列特征进一步表明其为L型半胱氨酸蛋白酶基因。这是首次在马铃薯腐烂茎线虫中克隆到的L型半胱氨酸蛋白酶,为今后在蛋白水平对其进行进一步的功能分析提供基础。     

枳PPF-1同源基因的克隆及分析

以枳[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]实生苗为材料,采用RT-PCR及RACE技术,获得了PPF-1(开花、衰老相关基因)同源基因的cDNA全长序列PtPPF-1,该cDNA全长1 493 bp,编码452个氨基酸,与豌豆PPF-1、拟南芥ALB3、水稻PPF-1及葡萄一未命名基因的氨基酸序列同源性较高,说明PPF-1基因在进化过程中可能变异较小。半定量RT-PCR分析表明PtPPF-1在叶片中表达量最高,顶芽和茎中相似,在根中未检测到,表明该基因功能与叶绿体有关。     

甘蔗茎尖离体培养褐变影响因素及细胞区室结构分析

该研究通过综合分析对甘蔗(ROC 22)茎尖离体培养褐变不同条件因素的影响以及褐变细胞区室结构的变化,探讨了甘蔗茎尖离体培养褐变的机理机制。结果表明:不同芽位茎尖诱导成活率具有明显差异,随着芽位的增加,诱导成活率不断降低;不同季节取芽对外植体茎尖总酚类物质含量无明显影响;但不同芽位及不同催芽天数,外植体芽的总多酚含量明显不同,随着催芽天数的增加,不同芽位的多酚含量呈现由低升高的趋势;蔗芽在培养4周时多酚含量较低,适宜进行采芽接种培养;从褐变甘蔗茎尖的解剖结构变化分析,褐变甘蔗茎尖细胞离体培养初期细胞核结构出现变形,线粒体有肿胀拉长,部分液泡膜开始分解;中后期质壁分离更为严重,胞质中出现大量溶酶体,线粒体等细胞器全分解,细胞膜、液泡膜、核膜、线粒体膜的双层膜结构出现破损和缺口;而正常发育的茎尖细胞,能基本保持细胞核的形态结构,只有少量的溶酶体出现。因此,可以推测细胞核和线粒体结构变形以及膜系统的大量破损是甘蔗茎尖培养褐变死亡的原因。     

普通荞麦植株茎段快速繁殖技术的研究

以普通养麦（Fagopyrum esculentum Moench）植株带节茎段为外植体,用正交设计法研究不同激素处理对荞麦腋芽、丛生芽和根的诱导及分化过程的影响,建立了荞麦离体培养快速繁殖技术。极差分析表明,6-BA是诱导荞麦茎段腋芽和根发育的主要因素,TDZ是诱导丛生芽的关键因素。诱导荞麦茎段腋芽发育的最佳培养基为：MS0＋6-BA1．0mg／L＋NAA0．1mg／L,腋芽诱导率为67．9％。其中,以第二、三节位的腋芽诱导率较高,达80％以上。诱导荞麦茎段丛生芽发育的最佳培养基为：MS0＋6-BA4．0mg／L＋TDZ0．06mg／L,丛芽分化率为166．7％。诱导生根的最佳培养基为：1／2MS0＋6-BA1．0mg／L＋NAA1．0mg／L,生根率为82．8％。该组织培养技术的建立为养麦快速繁殖提供了新途径。     

甘蔗双腋芽突变体表型鉴定及应用潜力评估

蔗茎腋芽是甘蔗无性繁殖的主要器官,充足的下芽量保证了甘蔗的高产稳产,但同时也造成用种量大、种植成本高,是生产上一直难以平衡的问题。本研究以大茎野生种创新利用过程中获得的1份蔗茎孪生双腋芽的突变体种质云蔗07-86为材料,对其双腋芽表型、稳定性、可遗传性及对产量的影响进行鉴定和测试。研究发现该突变体的双腋芽以孪生、邻接和分离3种方式随机着生于蔗茎中上部,通常从地上第6茎节开始发生双腋芽,发生频率自下而上呈现从无到有、先增后减的总体趋势,且播种后2个腋芽均能正常萌发;通过连续多年的无性繁殖大田试验观察发现,双腋芽性状能够在繁殖群体中稳定保持;利用该突变体与32份不同的甘蔗种质进行杂交,仅在11个组合中的极少数杂交后代无性系上观察到双腋芽现象,表明双腋芽性状可以通过杂交传递给后代,但双腋芽在后代群体中出现的概率极低;以相同下芽量分别将突变体单、双腋芽种茎进行种植,发现不同腋芽表型类型的有效茎数、蔗茎产量差异不显著,表明双腋芽突变体具备保证下芽量而降低用种量的应用潜力。本研究为后期开展双腋芽形成候选基因挖掘及双腋芽突变育种利用奠定基础。     

Suppression of sorghum axillary bud outgrowth by shade, phyB and defoliation signalling pathways

In recent years, several genetic components of vegetative axillary bud development have been defined in both monocots and eudicots, but our understanding of environmental inputs on branching remains limited. Recent work in sorghum ( Sorghum bicolor ) has revealed a role for phytochrome B (phyB) in the control of axillary bud outgrowth through the regulation of Teosinte Branched1 ( TB1 ) gene. In maize ( Zea mays ), TB1 is a dosage-dependent inhibitor of axillary meristem progression, and the expression level of TB1 is a sensitive measure of axillary branch development. To further explore the mechanistic basis of branching, the expression of branching and cell cycle-related genes were examined in phyB-1 and wild-type sorghum axillary buds following treatment with low-red : far-red light and defoliation. Although defoliation inhibited bud outgrowth, it did not influence the expression of sorghum TB1 ( SbTB1 ), whereas changes in SbMAX2 expression, a homolog of the Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana ) branching inhibitor MAX2 , were associated with the regulation of bud outgrowth by both light and defoliation. The expression of several cell cycle-related genes was also decreased dramatically in buds repressed by defoliation, but not by phyB deficiency. The data suggest that there are at least two distinct molecular pathways that respond to light and endogenous signals to regulate axillary bud outgrowth.     

Competitive canalization of PIN-dependent auxin flow from axillary buds controls pea bud outgrowth

Shoot branching is one of the major determinants of plant architecture. Polar auxin transport in stems is necessary for the control of bud outgrowth by a dominant apex. Here, we show that following decapitation in pea (Pisum sativum L.), the axillary buds establish directional auxin export by subcellular polarization of PIN auxin transporters. Apical auxin application on the decapitated stem prevents this PIN polarization and canalization of laterally applied auxin. These results support a model in which the apical and lateral auxin sources compete for primary channels of auxin transport in the stem to control the outgrowth of axillary buds.     

Identification and functional analysis of the MOC1 interacting protein 1

Rice tillering is one of the most important agronomic traits that determine grain yields.Our previous study has demonstrated that the MONOCULM1(MOC1)gene is a key component that controls the formation of rice tiller buds.To further elucidate the molecular mechanism of MOC1 involved in the regulation of rice tillering.we performed a yeast-two-hybrid screening to identify MOC1 interacting proteins(MIPs).Here we reported that MIP1 interacted with MOC1 both in vitro and in vivo.The overexpression of MIP1 resulted in enhanced tillering and reduced plant height.In-depth characterization of the context of MIP1 and MOC1 would further our understanding of molecular regulatory mechanisms of rice tillering.     

Identification and functional analysis of the MOC1 interacting protein 1

Rice tillering is one of the most important agronomic traits that determine grain yields.Our previous study has demonstrated that the MONOCULM1 (MOC1) gene is a key component that controls the formation of rice tiller buds.To further elucidate the molecular mechanism of MOC1 involved in the regulation of rice tillering,we performed a yeast-two-hybrid screening to identify MOC1 interacting proteins (MIPs).Here we reported that MIP1 interacted with MOC1 both in vitro and in vivo.The overexpression of MIP1 res...     

In planta transformation of sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) using TPS1 gene for enhancing tolerance to abiotic stresses

Journal of Genetics - An in planta transformation protocol for sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) using shoot apical meristem of germinating seedlings is reported in this study. Agrobacterium...     

So Close Yet So Different: Cultural Differences Among Farmers in Central Kenya Affect Their Knowledge of Sorghum (Sorghum bicolor [L.] Moench) Landrace Identification

Economic Botany - So Close Yet So Different: Cultural Differences among Farmers in Central Kenya Affect Their Knowledge of Sorghum (Sorghum bicolor [L.] Moench) Landrace Identification. Whether...